低劑量內皮-單核細胞激活多肽Ⅱ對人腦膠質瘤干細胞的腫瘤殺傷作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　越來越多的報道指出腫瘤內存在一小部分具有自我更新能力、多向分化潛能以及更強體內成瘤能力的細胞，稱為“腫瘤干細胞（Cancer Stem Cells，CSCs）”。膠質瘤中腫瘤干細胞的存在也被證實是導致其對化療不敏感，對放療抵抗及膠質瘤復發(fā)的根源。因此，靶向膠質瘤干細胞(Glioma Stem Cells，GSCs)的殺傷性治療已經(jīng)逐漸成為抗腦膠質瘤治療的核心。
　　內皮-單核細胞激活多肽Ⅱ(endothelial

2、 monocyte activating polypeptideⅡ，EMAPⅡ)是從甲基膽蒽A誘導形成的纖維肉瘤細胞的培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的，具有多種生物學功能。有報道指出EMAPⅡ在胰腺癌和肺癌中可通過誘導腫瘤血管內皮凋亡和抑制腫瘤血管生成從而能夠產(chǎn)生抑制腫瘤生長的作用。我們研究組前期還發(fā)現(xiàn)了EMAPⅡ可通過下調緊密連接蛋白從而能夠產(chǎn)生開放血腫瘤屏障的作用。但EMAPⅡ能否對膠質瘤細胞產(chǎn)生直接的腫瘤殺傷作用國內外尚未見報道，因此EMAPⅡ對腫

3、瘤細胞的直接殺傷作用仍然是一個嶄新的研究方向。
　　本研究圍繞EMAPⅡ能否對GSCs產(chǎn)生細胞毒性作用以及是否能夠誘導GSCs產(chǎn)生細胞周期阻滯來解析EMAPⅡ對GSCs產(chǎn)生的腫瘤殺傷作用。同時分析EMAPⅡ對GSCs產(chǎn)生的腫瘤殺傷作用的機制是否與凋亡或者自噬相關。進一步分析EMAPⅡ誘導GSCs自噬產(chǎn)生及誘導GSCs細胞周期阻滯的相關機制，進而闡明EMAPⅡ對GSCs產(chǎn)生腫瘤殺傷作用的分子機制，證實EMAPⅡ在抗人腦膠質瘤治療中具

4、有良好的應用前景。
　　材料和方法:
　　一、實驗材料
　?。ㄒ唬嶒灱毎?br>　　U87膠質瘤細胞系購自American Type Culture Collection(＜30代)。
　?。ǘ┲饕噭?br>　　EMAPⅡ，3-methyladenine（3-MA），胰島素樣生長因子-1(IGF-1)（美國PeproTech公司）;B27，EGF，b-FGF，DMSO（美國Sigma公司）;DMEM高糖培

5、養(yǎng)基（美國HyClone公司）;DMEM/F12/Glutamax和胎牛血清（美國Gibico公司）;細胞周期檢測試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）;線粒體膜電位檢測試劑盒及CCK-8檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）;細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）;染色質免疫共沉淀試劑盒（美國Cell Signaling Technology公司）;一抗LC3，p62/SQSTM1，Beclin-1，PI3K，p-PI3K，Akt，p-Ak

6、t，F(xiàn)oxO1和Atg2B（美國Abcam公司）;一抗p-FoxO1（美國Cell Signaling Technology公司）;一抗nestin，β-tubulinⅢ，GFAP和CD133（美國Millipore公司）;熒光二抗和一抗GAPDH（美國三塔生物技術有限公司）。
　　（三）實驗動物
　　健康雄性裸鼠，4-6周齡，建立移植瘤模型使用，由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院中心實驗室購買提供。
　?。ㄋ模┲饕獌x器

7、>　　細胞培養(yǎng)箱（美國Forma scientific公司）;超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）;倒置顯微鏡（日本TMS公司）;紫外-可見光分光光度計（日本島津公司）;BD FACSCalibur流式細胞儀（美國Becton-Dickinson公司）;超聲粉碎機（德國Dr.Hielscher公司）;臺式低溫超速離心機（德國Sigma公司）。聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置（美國Bio-Rad公司）;轉印儀（北京市六一儀器廠）;Las3000成

8、像系統(tǒng)（日本FUJIFILM公司);凝膠成像分析軟件（江蘇捷達科技有限公司）;Real-time PCR儀（美國ABI7500）;電子分析天平（德國Sartorius公司）;-80℃超低溫冰箱（日本SANYO公司）;恒溫震蕩水?。ü枮I市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司）;旋渦混合器（上海醫(yī)科大學儀器廠）。
　　二、實驗方法
　?。ㄒ唬︰87MG來源膠質瘤干細胞(GSCs)的分離培養(yǎng)，應用免疫熒光對提取的細胞球表面進行神經(jīng)干細胞標記

9、物CD133和nestin的檢測;同時應用免疫熒光對誘導GSCs多向分化后的細胞進行GFAP和β-tubulinⅢ的檢測，證實提取的細胞球細胞具有多向分化潛能。
　　（二）CCK-8證實不同濃度EMAPⅡ作用下產(chǎn)生抑制GSCs增殖能力的變化，明確EMAPⅡ的優(yōu)選濃度，并取該濃度應用于后續(xù)試驗中。
　?。ㄈ昧魇郊毎麅x雙標法檢測EMAPⅡ作用下誘導GSCs凋亡的產(chǎn)生。
　?。ㄋ模昧魇郊毎麅x檢測線粒體膜電位探針JC

10、-1熒光信號強度的變化，解析EMAPⅡ對GSCs線粒體膜電位的影響，明確EMAPⅡ作用下GSCs細胞活力的變化。
　?。ㄎ澹昧魇郊毎麅x檢測EMAPⅡ作用下GSCs細胞周期的改變。
　?。猛干潆婄R觀察EMAPⅡ作用下GSCs中自噬小體的產(chǎn)生。
　?。ㄆ撸妹庖邿晒鈾z測EMAPⅡ作用下GSCs中LC3和p62/SQSTM1的表達和分布變化，進一步驗證自噬小體的存在。
　　（八）應用western blo

11、t方法檢測自噬標志性分子LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉化，同時檢測其他自噬相關蛋白p62/SQSTM1、Beclin1及Atg2B的表達變化。
　?。ň牛肦eal time PCR和western blot方法檢測EMAPⅡ作用下GSCs中PI3K/Akt/FoxO1信號通路的改變。
　　（十）應用western blot方法驗證給予IGF-1或小干擾RNA使FoxO1的表達下降后對EMAPⅡ誘導GSCs產(chǎn)生自噬及細胞周期阻滯的

12、影響。
　?。ㄊ唬萌旧|免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）方法進一步明確EMAPⅡ誘導GSCs產(chǎn)生自噬的機制是否與FoxO1轉錄調節(jié)自噬相關基因蛋白Atg2B的表達相關。
　?。ㄊ┙⒙闶笃は乱浦擦瞿Ｐ?，觀察EMAPⅡ作用下對GSCs腫瘤生長的抑制作用，同時應用自噬抑制劑3-MA明確自噬在EMAPⅡ產(chǎn)生GSCs腫瘤殺傷作用中所起的作用，解析EMAPⅡ對GSCs產(chǎn)生的腫

13、瘤殺傷作用依賴于EMAPⅡ誘導GSCs產(chǎn)生的自噬性死亡。
　?。ㄊ┙y(tǒng)計學處理。
　　結果:
　　1、成功地分離并鑒定了U87MG來源的GSCs。
　　2、EMAPⅡ不同濃度0.05 nM、0.5 nM、5nM對GSCs產(chǎn)生細胞增殖的抑制作用差異不明顯，低劑量(0.05 nM) EMAPⅡ即可對GSCs產(chǎn)生明顯地腫瘤細胞增殖抑制作用，因此選擇了低劑量的EMAPⅡ用于后續(xù)的研究中。
　　3、低劑量EMAPⅡ

14、可明顯降低GSCs的細胞活力，在EMAPⅡ作用0.5h時效果最為明顯，隨著作用時間延長細胞活力逐漸恢復。自噬抑制劑3-MA可顯著逆轉EMAPⅡ對GSCs降低細胞活力的作用，提示EMAPⅡ對GSCs產(chǎn)生的細胞活力抑制作用與誘導GSCs產(chǎn)生的自噬有關。
　　4、低劑量EMAPⅡ作用下GSCs中未檢測到凋亡的產(chǎn)生。
　　5、低劑量EMAPⅡ可導致GSCs產(chǎn)生細胞周期G2/M期的阻滯，0.5h最為顯著，隨著作用時間延長細胞周期逐漸恢

15、復。
　　6、低劑量EMAPⅡ可誘導GSCs產(chǎn)生自噬，以0.5h最為明顯。
　　7、低劑量EMAPⅡ作用0.5h和1h可抑制GSCs中PI3K/Akt信號通路，進而可上調FoxO1的表達，促進FoxO1的核轉錄。
　　8、低劑量EMAPⅡ誘導GSCs產(chǎn)生的自噬現(xiàn)象和G2/M期阻滯依賴于PI3K/Akt/FoxO1信號通路。
　　9、FoxO1能夠結合到Atg2B的啟動子區(qū)，EMAPⅡ誘導GSCs產(chǎn)生的自噬與脂滴的

16、聚集依賴于FoxO1對Atg2B的轉錄調節(jié)。
　　10、低劑量EMAPⅡ可抑制在體GSCs腫瘤的生長，3-MA部分逆轉了EMAPⅡ對GSCs腫瘤生長的抑制作用。
　　結論:
　　1、EMAPⅡ能夠在其選擇性開放血腫瘤屏障的有效時間內同時產(chǎn)生對GSCs的直接殺傷作用。
　　2、EMAPⅡ對GSCs產(chǎn)生腫瘤殺傷作用的機制可能與EMAPⅡ誘導GSCs產(chǎn)生自噬性死亡和G2/M期阻滯相關。
　　3、EMAPⅡ可誘導G

17、SCs產(chǎn)生不完全自噬。
　　4、EMAPⅡ對GSCs產(chǎn)生腫瘤殺傷作用的分子機制之一可能與EMAPⅡ誘導GSCs產(chǎn)生不完全自噬進而導致蛋白過度蓄積產(chǎn)生的蛋白毒性增加有關。
　　5、EMAPⅡ作用下GSCs中大量脂滴的聚集可能是GSCs相對于U87MG特有的一種促存活機制。
　　6、EMAPⅡ可誘導GSCs中PI3K/Akt/FoxO1信號通路改變。
　　7、EMAPⅡ誘導GSCs產(chǎn)生不完全自噬和G2/M期阻滯可能依