宮頸癌患者Treg細胞及其Foxp3基因啟動子區(qū)甲基化水平的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、近年來,人們發(fā)現Treg細胞對于調節(jié)自身免疫反應、維持自身免疫耐受起到至關重要的作用,其負性免疫調節(jié)機制及與眾多疾病特別是惡性腫瘤間關聯已經被大量研究所證實。目前腫瘤免疫學領域普遍認為,Treg細胞抑制了抗腫瘤免疫功能,促進了惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Treg是一個異質性群體,大體可以分為兩個亞群,包括自然產生的Treg細胞(nTreg)和抗原誘導產生的Treg細胞(iTreg),2種亞群在細胞起源、抗原特異性及調節(jié)免疫抑制等方面不盡相同,目

2、前認為是iTreg細胞抑制了抗腫瘤免疫,而非nTreg細胞。由于nTreg和iTreg細胞沒有特異性的表型差異,因此目前尚無科學方法對二者進行區(qū)分。一般認為,在沒有受到抗原刺激的情況下,Treg細胞大多屬于nTreg,如果機體受到抗原刺激時,體內nTreg和iTreg則共存。因此,如果可以在腫瘤患者體內特異性甄別iTreg細胞與nTreg細胞,靶向去除iTreg細胞或針對性抑制其功能,將為腫瘤免疫治療帶來希望。
  Treg細胞免

3、疫抑制功能的發(fā)揮依賴于Foxp3分子的表達,Foxp3是轉錄因子forkhead/winged-helix(叉頭樣/翼狀螺旋)家族的成員,其編碼基因位于X染色體,Foxp3分子是賦予Treg細胞免疫抑制功能的主要分子。研究發(fā)現,nTreg細胞Foxp3呈持續(xù)而穩(wěn)定的表達,其免疫抑制功能因此能夠穩(wěn)定發(fā)揮,而體外誘導產生的iTreg,其Foxp3表達卻極不穩(wěn)定,可能需要體外培養(yǎng)環(huán)境中多種細胞因子,諸如TGF-β、IL-10、IL-2等的持續(xù)

4、刺激來維持其穩(wěn)定表達。相對于單純的體外研究環(huán)境,實際體內免疫環(huán)境要復雜的多,究竟哪種因素或由幾種因素協(xié)同作用誘導iTreg分化,并進一步調控Foxp3的表達卻不得而知。表觀遺傳學研究發(fā)現,人類Foxp3基因具有高度保守的非編碼區(qū)(conserved noncoding sequence,CNS),包括啟動子區(qū)及內含增強子區(qū),該區(qū)域富含CpG島,nTreg細胞CpG位點幾乎全部為去甲基化狀態(tài),而體外誘導產生的iTreg細胞該區(qū)域甲基化程度

5、增高。
  目的:
  眾所周知,宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展經歷了一個漫長過程,同時也是腫瘤免疫失衡的動態(tài)演變過程。Treg細胞在這一進程中處于負性免疫調控的中心。我們推測,腫瘤患者體內的Treg細胞,特別是iTreg細胞的負性免疫調控可能起到關鍵作用。本課題組通過采集臨床資料,動態(tài)研究宮頸癌患者Treg細胞Foxp3的表達變化及其啟動子區(qū)CpG位點甲基化水平,深入了解腫瘤患者體內Treg細胞的生物學特點,為今后的免疫靶向治療提供理

6、論依據。
  材料及方法:
  一、研究對象
  本實驗獲得解放軍202醫(yī)院臨床倫理委員會批準,所有參加者均被告研究目的,并簽署知情同意書。簡單隨機抽樣分組,隨機選取2013年1月至2014年6月間本院婦科病房收治的早期宮頸癌患者(FIGO分期為Ⅰa2~Ⅱa1期)25例,臨床分期Ⅰa2期5例,Ⅰb1期7例,1b2期8例,Ⅱa1期5例;組織學類型鱗癌20例,腺癌4例,腺鱗癌1例。HSIL(high-grade squam

7、ous intereapithelial lesion,又稱為宮頸鱗狀上皮內高度病變)患者[1]20例,其中宮頸癌患者均采用廣泛性子宮切除及盆腔淋巴結清掃術,術前未行放化療,如術后需輔助治療,均于術后一個月進行;HSIL患者采用LEEP局部切除術;同期內收集我院行體檢的健康志愿者(TCT及HPV檢測均陰性)10例作為正常健康對照。上述患者和正常對照者平均年齡分別為43.8+4.4歲、44.1±5.0歲39.5±2.7歲,組間無顯著性差異

8、(P<0.05),所有研究對象無嚴重感染、結締組織病、自身免疫病、代謝病(糖尿病除外)和其他嚴重的慢性疾患(如晚期肝硬化、未經治療的甲狀腺功能亢進或減退等),近3個月未行免疫治療。
  二、主要試劑與儀器
  主要試劑:eBioscience公司Treg細胞流式檢測試劑盒(鼠抗人CD4-FITC、CD25-APC,Foxp3-PE單克隆抗體)及同型IgG熒光對照;美天旎公司人Treg磁珠分離試劑盒;ZYMO RESEARCH

9、公司DNA甲基化試劑盒;上海生工PCR引物;人TGF-β、IL-10 ELISA試劑盒等。
  主要儀器:BD公司FACS CantoⅡ型流式細胞儀,PCR儀,RT-PCR儀,自動測序儀,全自動酶標儀,電泳儀(槽),低速離心機,紫外凝膠成像系統(tǒng)等。
  三、標本采集與檢測方法
  1、所有受試對象(除外健康自愿者)于術前及術后不同時期抽取清晨空腹肘靜脈血8 ml,分別注入EDTA管6ml及非抗凝管2ml,立即置入冰盒送

10、解放軍202醫(yī)院優(yōu)生優(yōu)育實驗室檢測。
  2、Ficoll密度梯度分離人外周血單個核細胞(PBMC)
  向2只無菌25ml離心管中加入5ml淋巴細胞分離液;將6ml EDTA抗凝靜脈血液與等量Hanks液充分混勻,用滴管沿管壁緩慢滴加于分層液面上,注意保持清楚界面;2000rm離心20min,離心管內分為三層,在上、中層界面處有一處單核細胞聚集的白色云霧狀窄帶;用毛細管插入此層中吸出單個核細胞;用5倍體積的Hanks洗滌液

11、,上下顛倒混勻,1500rm離心5min,棄上清,再重復洗滌、離心,最后加入10%胎牛血清RPMI1640,重懸細胞,細胞計數,添加Hanks平衡液使最終PMBC濃度達到1×107/ml。
  3、流式細胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞
  按試劑盒說明操作:取含1×106個新鮮人外周血PMBC懸液各100μl,分為4組:空白對照管、FITC標記的CD4單抗單標對照樣本管、PE標記的CD25單抗單標對照樣本

12、管、PE-Cy5標記的Foxp3單抗單標對照樣本、三標檢測管;加入300μl冷的流式染色緩沖液,充分吹打及4℃避光孵育;開機,10min穩(wěn)定,以前向散射角(FSC)為橫坐標、側向散射角(SSC)為縱坐標的二維散點圖上,調整參數、閾值,排除碎片和噪聲干擾,以CD4設門,以CD4為橫坐標,SSC為縱坐標,淋巴細胞分為CD4+T細胞和CD4-T細胞,在CD4+T細胞中,以CD25設門,分析檢測CD4+CD25+ Foxp3+Treg細胞數量及

13、所占CD4+CD25+Treg細胞比例。
  4、磁珠分選CD4+CD25+Treg細胞。
  5、采用ELISA試劑盒檢測TGF-β、IL-10的含量。
  6、亞硫酸氫鈉修飾的甲基化測序技術(bisulfite sequencing PCR,BSP)對宮頸癌患者Treg細胞Foxp3基因啟動子區(qū)CpG位點進行甲基化檢測及測序。
  7、采用RT-PCR技術檢測Treg細胞內甲基化轉移酶(DNMTs)的表達。<

14、br>  結果:
  1、宮頸癌及HSIL患者分別與對照組比較,外周血中CD4+CD25+Treg/CD4+T及CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+細胞比例均呈顯著增加(P<0.05);術后1周,CD4+CD25+Treg/CD4+T細胞比例無明顯變化,而CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+細胞比例卻出現顯著降低(P<0.05);術后1個月與術后1周比較,CD4+CD25+Treg/CD4+T比例出現了明顯

15、下降(P<0.05),而CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+細胞比例較術后1周卻無明顯變化;HSIL與宮頸癌患者之間比較始終無明顯統(tǒng)計學差異。
  2、Treg細胞相關免疫細胞因子TGF-β、IL-10在宮頸癌及HSIL患者血清中表達水平較對照組顯著升高(P<0.05),術后1周及術后1月,其表達水平又出現顯著性降低(P<0.05);其表達水平與外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的數量變化呈正相關(P<

16、0.05);而與CD4+CD25+Treg細胞的數量變化卻未見明顯相關。
  3、對宮頸癌及HSIL患者外周血CD4+CD25+Treg細胞Foxp3基因啟動子區(qū)(-204~+12bp)8個CpG位點進行焦硫酸測序發(fā)現,其Foxp3基因啟動子區(qū)(-138,-77,-65)CpG位點甲基化水平較對照組顯著升高(P<0.05); DNA甲基化轉移酶(DNMT1、DNMT3a) mRNA表達水平亦較對照組明顯升高(P<0.05);而術后

17、一個月,DNMT1、DNMT3a表達水平呈顯著下降,較對照組比較無統(tǒng)計學差異。宮頸癌和HSIL患者無論是在甲基化位點、表達水平,還是在甲基化轉移酶表達水平方面均無顯著性差異。
  結論:
  1、宮頸癌及HSIL患者外周血Treg細胞Foxp3表達具有不穩(wěn)定性,其表達水平與抑制性細胞因子TGF-β、IL-10表達水平呈正相關,二者可能共同參與形成了宮頸腫瘤患者體內的免疫抑制環(huán)境,為評估腫瘤患者的免疫狀態(tài),臨床治療效果以及預后

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