黑色素瘤相關抗原MAGe-A家族在食管鱗癌和賁門癌中的表達及其意義.pdf

1、腫瘤嚴重的威脅著人類健康，其中以胃癌、食道癌、大腸癌為代表的消化道癌癥威脅最為顯著。由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制的復雜性，尋找高效的治療方法也面臨著巨大挑戰(zhàn)。免疫療法的提出為腫瘤的治療指明了新的方向。該療法可通過增強腫瘤抗原的免疫原性以刺激自身特異性免疫應答，進而攻擊腫瘤細胞。因此尋找腫瘤特異性抗原成為免疫療法的關鍵。黑色素瘤相關抗原(Melanoma antigen，MAGE)正是這樣一群腫瘤特異性抗原。
　　本課題組一直致力于MAG

2、E-A家族在腫瘤中表達意義的研究。本研究利用免疫組織化學法分別檢測MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12）、MAGE-A9和MAGE-A11在食管鱗癌組織、賁門腺癌組織、相應癌旁正常食管和胃組織中的表達及與其臨床生物學指標之間的關系，特別是預后意義。并通過實時熒光定量RT-PCR(Real-timequantitative PCR，qRT-PCR)驗證前期通過基因芯片篩選出的與MAGE-A

3、11相關的多種基因，以期為MAGE-A家族成為食管癌和賁門癌的腫瘤特異性指標提供理論依據(jù)，并試圖闡述其作用機制。主要研究內(nèi)容和結果如下:
　　第一部分 MAGE-A家族在食管鱗癌和賁門腺癌組織中的表達情況及臨床意義
　　目的:
　　探討黑色素瘤相關抗原MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12）、-A9和-A11在食管鱗癌組織、賁門腺癌組織，相應癌旁正常組織中的表達及與其臨床

4、生物學指標之間的關系，特別是預后意義。
　　方法:
　　1、應用免疫組織化學法在睪丸組織中驗證MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)、-A9和-A11的特異性。
　　2、應用免疫組織化學法檢測60例食管鱗癌、30例賁門腺癌組織及相應癌旁正常粘膜組織中MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)、-A9和-A11蛋白的表達，分析

5、其與患者臨床生物學指標及其預后的關系。
　　結果:
　　1、MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)蛋白正常睪丸組織，食管鱗癌和賁門腺癌中均有表達。在正常睪丸組織中尤其精原細胞和精母細胞核中均顯著表達。MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12）蛋白在癌組織中主要定位于細胞質(zhì)，部分定位于細胞核。60例食管鱗癌和30賁門腺癌旁正常組織中

6、未發(fā)現(xiàn)MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12）蛋白表達，食管鱗癌組織中MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12）的陽性率為68.33％(41/60);賁門腺癌組織中MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)的陽性率為56.67％(17/30)。
　　在食管鱗癌組織中，MAGE-As(包括MAG

7、E-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)蛋白表達與食管鱗癌患者的年齡、臨床分期、組織學分級、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移均無相關性(P＞0.05)。
　　在賁門腺癌組織中，MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)蛋白與組織學分級(P＜0.05)呈正相關，MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)蛋白表達與賁門腺癌患者的年齡、臨

8、床分期、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移均無相關性(P＞0.05)。
　　2、MAGE-A9蛋白正常睪丸組織，食管鱗癌和賁門腺癌中均有表達。在正常睪丸組織中尤其精原細胞和精母細胞核中均顯著表達。MAGE-A9蛋白在癌組織中主要定位于細胞質(zhì)，部分定位于細胞核。60例食管鱗癌和30例賁門腺癌旁正常組織中未發(fā)現(xiàn)MAGE-A9蛋白表達，食管鱗癌組織中MAGE-A9的陽性率為45％(27/60);賁門腺癌組織中MAGE-A9的陽性率為43.33％(13/

9、30)。
　　在食管鱗癌組織中，MAGE-A9蛋白表達與組織學分級(P＜0.05)呈正相關，MAGE-A9蛋白與食管鱗癌患者的年齡、臨床分期、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移均無相關性(P＞0.05)。
　　在賁門腺癌組織中，MAGE-A9蛋白與組織學分級(P＜0.05)呈正相關，MAGE-A9蛋白表達與賁門腺癌患者的年齡、臨床分期、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移均無相關性(P＞0.05)。
　　3、MAGE-A11蛋白正常睪丸組織，食管鱗癌和

10、賁門腺癌中均有表達。在正常睪丸組織中尤其精原細胞和精母細胞核中均顯著表達。MAGE-A11蛋白在癌組織中主要定位于細胞質(zhì)，部分定位于細胞核。60例食管鱗癌和30例賁門腺癌旁正常組織中未發(fā)現(xiàn)MAGE-A11蛋白表達，食管鱗癌組織中MAGE-A11的陽性率為66.67％(40/60);賁門腺癌組織中MAGE-A11的陽性率為53.33％(16/30)。
　　在食管鱗癌組織中，MAGE-A11蛋白表達與臨床分期和腫瘤大小(P＜0.05)

11、呈正相關，MAGE-A11蛋白與食管鱗癌患者的年齡、組織學分級、淋巴轉(zhuǎn)移均無相關性(P＞0.05)。
　　在賁門腺癌組織中，MAGE-A11蛋白與臨床分期和組織學分級(P＜0.05)呈正相關，MAGE-A11蛋白表達與賁門腺癌患者的年齡、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移均無相關性（P＞0.05）。
　　460例食管鱗癌組織標本中，MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12）、-A9和-A11蛋白

12、表達呈均勻分布，三種蛋白同時表達的有19例，占31.67％(19/60)。60例食管鱗癌中三種蛋白陽性表達率之間有明顯差異(x2=8.472，P=0.014)且MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)的表達率高。
　　5、30例賁門腺癌組織標本中，MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)、-A9和-A11蛋白表達呈均勻分布，三種蛋白同時

13、表達的有11例，占36.67％(11/30)。30例賁門腺癌中三種蛋白陽性表達率之間沒有明顯差異（x2=1.156，P=0.561）。
　　6、MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12），-A9和-A11蛋白表達陽性的食管鱗癌患者和賁門腺癌患者的生存期均顯著低于其表達陰性的患者。
　　結論:
　　MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和

14、-A12）、-A9和-A11蛋白是食管癌和賁門癌特異性抗原。MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)、-A9和-A11蛋白可作為食管鱗癌和賁門腺癌預后不良的指標。
　　第二部分對基因芯片中篩選出的MAGE-A11相關基因的初步驗證
　　目的:
　　以期驗證基因芯片篩選出的與MAGE-A11相關的多種基因，CEP295(centrosomal protein295kDa,

15、CEP295)、TRIM33(tripartite motif containing33, TRIM33)、KIF23(kinesin family member23, KIF23),FN1(fibronectin1, FN1)、CKAP5(cytoskeleton associated protein5,CKAP5)、PNN(pinin,desmosome associated protein, PNN), MMP13(matrix

16、metallopeptidase13,MMP13)、MMP26(matrix metallopeptidase26,MMP26)和MMP28(matrixmetallopeptidase28，MMP28)在轉(zhuǎn)染MAGE-A11質(zhì)粒組與轉(zhuǎn)染空載體組之間mRNA的表達水平的差異，探討MAGE-A11在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中可能的作用機制，為闡明MAGE-A11在食管癌中的作用提供初步理論依據(jù)。
　　方法:
　　實時免疫熒光定量PC

17、R驗證:引物的設計:登錄GENEBANK網(wǎng)站，設計上、下游引物。嵌合熒光法(SYBR(R)Green I)PCR:采用ABI SYBR(R)Green熒光定量PCR方法（具體反應體系見ABI SYBR(R) Green熒光定量PCR方法說明）。
　　結果:
　　1、在轉(zhuǎn)染MAGE-A11質(zhì)粒的Eca109食管癌細胞系中，CEP295、TRIM33、KIF23、FN1、MMP13、MMP26和MMP28mRNA的表達水平顯著高

18、于空轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組。MAGE-A11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)了CEP295、TRIM33、KIF23、FN1、MMP13、MMP26和MMP28基因的轉(zhuǎn)錄水平，CKAP5和PNNmRNA的表達水平顯著低于空轉(zhuǎn)染組。MAGE-A9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染下調(diào)了CKAP5和PNN基因的轉(zhuǎn)錄水平，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2、在轉(zhuǎn)染MAGE-A11質(zhì)粒的TE-1食管癌細胞系中，CEP295、TRIM33、KIF23、FN1、MMP13、MMP26和

19、MMP28mRNA的表達水平顯著高于空轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組。MAGE-A11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)了CEP295、TRIM33、KIF23、FN1、MMP13、MMP26和MMP28基因的轉(zhuǎn)錄水平，CKAP5和PNN mRNA的表達水平顯著低于空轉(zhuǎn)染組。MAGE-A11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染下調(diào)了CKAP5和PNN基因的轉(zhuǎn)錄水平，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　3、在轉(zhuǎn)染MAGE-A11質(zhì)粒的TE-13食管癌細胞系中，CEP295、TRIM33、KI

20、F23、FN1、MMP13、MMP26和MMP28mRNA的表達水平顯著高于空轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組。MAGE-A11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)了CEP295、TRIM33、 KIF23、FN1、MMP13、MMP26和MMP28基因的轉(zhuǎn)錄水平，CKAP5和PNNmRNA的表達水平顯著低于空轉(zhuǎn)染組。MAGE-A11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染下調(diào)了CKAP5和PNN基因的轉(zhuǎn)錄水平，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　MAGE-A11通過調(diào)控泛素化相