昆蟲Piwi蛋白及microRNA的生物信息學預測與進化分析.pdf

1、Piwi蛋白是Argonaute蛋白家族的一個亞家族，它通過與一類跟精子發(fā)生有關的小RNA的相互作用來調控基因的表達。Piwi蛋白參與干細胞的自我調控及精子的發(fā)生。對Piwi蛋白的研究有利于我們闡明該蛋白的生物學功能，也能促進對piRNA(Piwi-interacting RNA)的了解。我們利用生物信息學同源搜索的方法在昆蟲基因組中搜索piwi的同源基因。利用EST延伸技術以及最新版本的GENSCAN軟件預測基因的結構，進一步拼接出基

2、因的全長或部分cDNA序列。通過比較基因結構，我們發(fā)現(xiàn)脊椎動物和無脊椎動物中的Piwi蛋白的外顯子數(shù)目之間存在差異，哺乳動物的piwi基因含有20個外顯子，而昆蟲只有6-9個。我們推測Piwi蛋白在進化過程中可能發(fā)生了內含子丟失或獲得的事件。在所有預測的Piwi-1ike蛋白中都發(fā)現(xiàn)了兩個特征性的結構域：PAZ和PIWI結構域。使用MEME軟件預測蛋白結構，結果獲得了6個保守的基序(Motif)，這些基序中包含了一個三聯(lián)體的催化位點“A

3、sp-Asp-His/Lys”，這個催化位點是Piwi蛋白行使剪切活性時所必需的。通過RT-PCR實驗我們進一步驗證了家蠶中siwi1和siwi2蛋白的表達。最后，對Piwi蛋白家族做了系統(tǒng)進化分析，進化樹結果顯示無脊椎動物中的Piwi同源蛋白可以分為三個枝，其中昆蟲的Ago3蛋白與哺乳動物Piwi蛋白位于相鄰進化枝上。 剛剛測序結束的11種果蠅的基因組為我們進一步分析Piwi蛋白以及比較相近物種之間的進化關系提供了很好的材料。

4、果蠅Piwi蛋白家族可分為三類：piwi、Aub以及Ago3。它們因參與一類跟精子發(fā)生有關的小RNA的通路而引起廣泛的關注。我們在之前研究工作的基礎上進一步分析了11種果蠅基因組中的Piwi蛋白，結果獲得了33個piwi的同源基因，并且發(fā)現(xiàn)果蠅的piwi和Aub基因在基因組上相距20kb以內。利用最新版本的GENSCAN軟件預測基因結構，結果獲得了22個全長的cDNA序列，而在我們之前的工作中只拼接出6個完整的ORF。這22個全長的基因

5、主要集中在piwi和Aub基因，而Ago3基因因含有較長的內含子導致很難拼接出全長序列。基因結構比較發(fā)現(xiàn)，piwi(1284bp)和Aub(840bp)基因的第一個內含子的長度明顯大于剩余的其它內含子的長度(piwi平均為93bp和Aub平均為54bp)。而這種現(xiàn)象在哺乳動物中沒有發(fā)現(xiàn)。另外發(fā)現(xiàn)Ago3基因的內含子和外顯子中分布著大量的重復序列。其中有四個果蠅的第三個內含子中由于長末端重復序列(LTR)的插入而顯示出很強的保守性。進化分

6、析的結果跟之前研究工作的結論一致，昆蟲的Ago3基因與哺乳動物的piwi基因在進化樹上位于相鄰的進化枝中。 MicroRNAs(miRNAs)是一類長度約22m的內源性的非編碼小RNA，它通過與Argonaute蛋白家族中的AGO亞家族結合去調控基因的表達，降解mRNA或抑制翻譯。從家蠶的卵、幼蟲、蛹和成蟲四個齡期提取總的RNA并利用sequence-by-synthesis(SBS)的方法進行測序。本文利用生物信息學的方法和計

7、算機編程的技術從家蠶的SBS數(shù)據(jù)中預測microRNA基因。從家蠶四個時期樣本中總計測序得到了2，227，930個序列，其中1，144，485分布于17到25nt范圍內，得到相應的256，604單一序列。有95，184序列完全匹配到家蠶的基因組中。利用生物信息學流程以及RNAfold軟件和TripletSVM算法，我們初步得到了3,750個可能的microRNA。利用microRNA芯片，我們驗證有354個mieroRNA是真實存在?；?/p>

8、因組定位分析發(fā)現(xiàn)，Scaffold001808上連續(xù)分布了19個成簇分布的microRNA，EST表達分析暗示著這些microRNA是表達的。家蠶不同發(fā)育階段的microRNA表達譜分析，發(fā)現(xiàn)有106個microRNA在家蠶發(fā)育中廣泛表達，248個microRNA是在卵和蛹高表達的，這暗示microRNA在昆蟲的胚胎和變態(tài)發(fā)育中起著重要作用。通過RT-PCR實驗，進一步驗證了我們預測結果的可靠性。此外我們對人、小鼠、線蟲和已經公布基因組