Tbx18轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)小鼠心臟干細(xì)胞向起搏樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過(guò)腺病毒介導(dǎo)，上調(diào)Tbx18在小鼠心臟干細(xì)胞(Cardiac stem cells, CSCs)的表達(dá)，探討其是否可誘導(dǎo)小鼠 CSCs向起搏樣細(xì)胞分化。
　　方法：1、小鼠CSCs的培養(yǎng)、分離：取SPF級(jí)昆明小鼠心臟組織，通過(guò)心肌組織塊貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)原代小鼠CSCs；待CSCs生長(zhǎng)至約80％融合度后，利用差速消化法分離并收集；重新鋪板后行C-kit+免疫熒光鑒定。2、實(shí)驗(yàn)分組：將原代CSCs分為三組：①空白對(duì)照組：原代CS

2、Cs培養(yǎng)；②陰性對(duì)照組：以不含Tbx18基因的空病毒感染CSCs；③Tbx18實(shí)驗(yàn)組：Tbx18過(guò)表達(dá)腺病毒感染CSCs。3、Tbx18過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建：以Tbx18質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，重組到質(zhì)粒載體后行基因測(cè)序，并與目的基因序列對(duì)比驗(yàn)證；4、Tbx18過(guò)表達(dá)腺病毒的包裝和滴度測(cè)定：用構(gòu)建好的Tbx18過(guò)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞進(jìn)行包裝，Western-blot檢測(cè)包裝結(jié)果，收集病毒并擴(kuò)增，檢測(cè)病毒滴度；5、Tbx1

3、8感染 CSCs可行性驗(yàn)證：觀察感染Tbx18腺病毒后CSCs的生長(zhǎng)情況及形態(tài)學(xué)變化， Western-blot檢測(cè)Tbx18在小鼠CSCs中的表達(dá)；6、上調(diào)Tbx18誘導(dǎo)CSCs定向分化為起搏樣細(xì)胞的驗(yàn)證：Tbx18過(guò)表達(dá)腺病毒感染CSCs后繼續(xù)培養(yǎng)第6天，qPCR和Western-blot分別檢測(cè)小鼠CSCs中HCN4在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)果：1、心臟組織塊貼壁培養(yǎng)法獲取原代小鼠CSCs：鋪皿4小時(shí)后心臟組織

4、塊開(kāi)始貼壁，1～2天貼壁牢固，組織塊周圍開(kāi)始有成纖維細(xì)胞長(zhǎng)出；5～7天，心肌組織塊周圍長(zhǎng)出小、圓、亮的CSCs，其生長(zhǎng)于成纖維細(xì)胞上層，高倍鏡下不能觀察到核仁；13～15天， CSCs生長(zhǎng)至融合度約80％后消化分離并收集；C-kit+免疫熒光鑒定，熒光顯微鏡下隨機(jī)挑選5個(gè)視野，計(jì)算GFP陽(yáng)性細(xì)胞占所在視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的百分比，取平均值為75％。2、成功完成 Tbx18載體的構(gòu)建，基因測(cè)序與預(yù)期序列完全一致；Tbx18感染HEK293T細(xì)胞

5、后第2天觀察到綠色熒光表達(dá)，10～12天熒光強(qiáng)度達(dá)最高，收集病毒液；測(cè)定病毒滴度為1.0×1010IFU/ml；Western-Blot檢測(cè)HEK293T細(xì)胞中Tbx18蛋白高表達(dá)。3、Tbx18重組腺病毒感染CSCs后，細(xì)胞在繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中，大部分細(xì)胞發(fā)生不典型的形態(tài)變化，呈梭形及不規(guī)則形，較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組無(wú)明顯差異；Tbx18重組腺病毒感染CSCs后24小時(shí)可見(jiàn)綠色熒光表達(dá)，72小時(shí)熒光強(qiáng)度最高，MOI值為800；Tbx18

6、實(shí)驗(yàn)組Western-blot檢測(cè)到69KD大小的Tbx18蛋白，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組均無(wú)Tbx18蛋白表達(dá)；4、Tbx18感染小鼠CSCs后第6天，qPCR、Westeron-blot檢測(cè)顯示，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和Tbx18實(shí)驗(yàn)組均未檢測(cè)到HCN4在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)論：1、組織塊貼壁培養(yǎng)法獲得小鼠CSCs是穩(wěn)定、可靠的，C-kit+CSCs占原代心臟干細(xì)胞總數(shù)的75％；2．成功構(gòu)建Tbx18重組腺病毒