全反式視黃酸拮抗糖基化終末產(chǎn)物受體及下調(diào)氧化應激抑制心肌缺血再灌注損傷機制研究.pdf

1、【目的】：
　　當前我國急性ST段抬高型心肌梗死（ST-elevated Myocardial Infarction，STEMI）的發(fā)病率逐年增高，雖然心肌再灌注治療已成為廣泛開展的治療措施，但臨床療效仍受多種因素干擾。在基礎研究方面，心肌缺血再灌注損傷（Ischemia/Reperfusion Injury，I/R injury）極大地影響了再灌注治療的療效，目前尚無滿意的預防和干預措施，因此也未形成規(guī)范治療方案。
　　本

2、研究的目的是通過基礎研究，探索可行的STEMI再灌注治療后I/R損傷的防治方法。通過嘗試應用全反式視黃酸（All-Trans Retinoic Acid，ATRA）防治心肌梗死再灌注后 I/R損傷，闡明 ATRA在心肌 I/R中的作用機制及其對糖基化終末產(chǎn)物受體（Receptor for Advanced Glycation Endproducts，RAGE）效應機制的關系。具體建立心肌細胞和活體動物心肌梗死后 I/R損傷模型，檢測 A

3、TRA是否能夠有效抑制心肌 I/R損傷，探索能夠有效消除RAGE介導的心肌I/R損傷及其他可能的機制，并總結和探索可行的I/R損傷防治策略，為有效預防和干預心肌I/R提供理論依據(jù)和干預方法。
　　【方法】：
　?。?）建立 H9C2心肌細胞缺氧再氧模擬的I/R損傷模型，比較不同濃度(10nM-100uM)的ATRA干預下，心肌細胞存活率，確定ATRA的有效濃度和毒性濃度；膜聯(lián)蛋白V凋亡檢測結合流式細胞學檢測方法檢測不同濃度A

4、TRA的抗心肌細胞凋亡作用；用TUNEL染色方法檢測ATRA抗凋亡作用；用Western-blots方法檢測心肌梗死再灌注后凋亡相關信號天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specificproteinase-3，Caspase-3）、B淋巴細胞瘤蛋白-2（B-cell lymphoma-2，BCL-2）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p3

5、8MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）表達差異；
　?。?）在H9C2細胞缺氧再氧模擬的I/R損傷平臺上，用Western-blots方法檢測不同濃度ATRA干預下去整合素樣金屬蛋白酶10（A disintegrin and metalloproteinase10，A

6、DAM10）和 RAGE表達差異；應用ADAM10-短發(fā)夾核糖核酸（short hairpin ribonucleic acid，shRNA）干擾，重復上述實驗，用Western-blots方法檢測Capase-3、BCL-2、p38MAPK、JNK、ERK表達差異；用Carboxy-H2DCFDA試劑檢測不同濃度ATRA干預下細胞內(nèi)氧化應激程度；
　?。?）建立小鼠左前降支（left anterior descending ar

7、tery，LAD）結扎及再通模型模擬在體I/R損傷，用TTC染色方法檢測ATRA干預下野生型小鼠和RAGE基因敲除小鼠心肌梗死范圍差異；用超聲學方法檢測ATRA干預下小鼠I/R損傷后左室功能相關指標；用TUNEL染色方法檢測ATRA干預下小鼠I/R損傷后心肌細胞凋亡的差異；用Western-blots方法檢測ATRA干預下小鼠I/R損傷后Capase-3、BCL-2、p38MAPK、JNK、ERK表達差異；用免疫組織化學染色方法測定AT

8、RA干預小鼠I/R損傷后，組織切片中的凋亡信號p38MAPK、JNK、ERK，以及ADAM10和RAGE表達差異。
　　【結果】：
　?。?） H9c2細胞經(jīng) I/R損傷后，相比二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）對照組，用1nM至10μM的ATRA預處理組存活細胞數(shù)量顯著升高（p<0.01），但100μM濃度ATRA預處理組則表現(xiàn)為存活細胞數(shù)量大幅度降低（p<0.01）；應用ATRA濃度范圍10nM到

9、10μM預處理組各組的膜聯(lián)蛋白陽性，即凋亡細胞比例顯著減少（p<0.01），且表現(xiàn)為濃度依賴性；TUNEL染色結果顯示ATRA終濃度為10nM到10μM預處理組中，TUNEL陽性細胞數(shù)，即凋亡細胞數(shù)量顯著下降（p<0.01），且表現(xiàn)為濃度依賴性；用Western blot方法檢測ATRA終濃度為1nM到10μM細胞凋亡的直接介導因子活化的caspase-3水平顯著下降，保護因子BCL-2水平顯著升高，凋亡信號p38MAPK、JNK、ER

10、K表達水平顯著下降（all p<0.01），上述效應也表現(xiàn)為濃度依賴性。
　?。?） H9c2細胞經(jīng)I/R損傷后，ATRA濃度在10nM-10μM范圍內(nèi)，ADAM10表達水平較DMSO對照組顯著升高，而RAGE表達水平則顯著降低（p<0.01），且分別表現(xiàn)出正相關性和負相關性；ADAM10-shRNA可有效沉默ADAM10表達（p<0.01），且RAGE表達顯著上調(diào)（p<0.01），同時應用用ATRA1μM未能顯著恢復ADAM10

11、表達，也未能顯著降低由于ADAM10效應沉默后引起的RAGE高表達（p>0.05）；ADAM10-shRNA沉默ADAM10表達后，Caspase-3表達顯著升高（p<0.01），而BCL-2表達顯著降低（p<0.01）；同時用ATRA1μM和ADAM10-shRNA時，Caspase-3表達較單純應用ADAM10-shRNA顯著降低（p<0.01），BCL2表達顯著升高（p<0.01），但Caspase-3表達較單純應用ATRA1μM

12、顯著升高（p<0.01），BCL2表達較單純應用ATRA1μM顯著降低（p<0.01）；用ADAM10-shRNA沉默 ADAM10效應后，凋亡信號p38MAPK、JNK、ERK磷酸化激活表達均顯著升高（all p<0.01）；同時用ATRA1μM和ADAM10-shRNA處理后，凋亡信號p38MAPK、JNK、ERK磷酸化激活水平分別較單純應用ADAM10-shRNA顯著降低（p<0.01），但較單純應用ATRA1μM顯著升高(p<0

13、.01)；經(jīng)ATRA濃度在10nM-10μM范圍內(nèi)預處理后，用Carboxy-H2DCFDA反應液檢測細胞內(nèi)ROS含量顯著降低（p<0.01），且表現(xiàn)為濃度依賴性。
　　（3） TTC染色結果顯示在野生型小鼠中應用ATRA預處理顯著降低了心肌I/R損傷后梗死面積（p<0.05），在糖基化終末產(chǎn)物基因敲除小鼠中，無論是否應用ATRA預處理，心肌 I/R損傷后梗死面積與野生型對照組相比都顯著降低（p<0.05）；超聲學檢測結果顯示經(jīng)過

14、ATRA預處理并進行I/R損傷造模后，小鼠心輸出量、左室舒張末期容積、射血分數(shù)較未進行 I/R損傷造模組顯著降低（p<0.05），但心輸出量和射血分數(shù)仍顯著高于未經(jīng)ATRA預處理組（p<0.05）；心肌組織切片TUNEL染色結果顯示應用ATRA預處理較直接I/R損傷造模小鼠心肌細胞凋亡數(shù)量顯著減少（p<0.05）；應用ATRA預處理后并后進行 I/R損傷造模后，左室心肌組織細胞內(nèi)凋亡保護信號BCL-2表達水平顯著升高（p<0.05），而

15、凋亡直接信號 Caspase-3表達水平顯著降低（p<0.05），凋亡信號 p38MAPK、JNK、ERK的磷酸化激活水平顯著降低（p<0.05）；免疫組織化學染色結果顯示應用ATRA預處理后，梗死區(qū)域心肌凋亡信號p38MAPK、JNK、ERK磷酸化激活水平顯著降低（p<0.05）；而ADAM10表達水平顯著升高（p<0.05），RAGE表達水平顯著降低（p<0.05）。
　　【結論】：
　　本研究證實ATRA可有效防治ST