超聲聯(lián)合微泡介導shRNA-PHD2轉染治療大鼠急性心肌梗死.pdf

1、目的:HIF-1α是可被PHD2降解的一種核心調(diào)節(jié)因子。當心肌缺血再灌注時，上調(diào)HIF-1α能夠激活下游血管新生基因。盡管應用裸質(zhì)?；虿《据d體基因轉染治療心血管疾病已取得成功，但基因治療仍存在不少尚未解決的問題，如如何安全高效的將其轉染至靶細胞并能持續(xù)表達，同時可以減少宿主細胞的損傷。近年來超聲靶向微泡破壞技術由于其安全、有效、重復性高等優(yōu)點，成為一種新型的可以作為急性心肌梗死的基因療法，PEI作為一種聚陽離子，可以與DNA發(fā)生靜電作用

2、，保護其免受核酸酶的破壞。本文旨在研究超聲靶向破壞微泡介導shRNA-PHD2治療大鼠急性MI。
　　方法:建立SD大鼠急性心肌梗死模型，首先將30只大鼠分為 Plasmid、Plasmid+US及Plasmid+UTMD三組，大鼠在轉染4天后安樂死，獲取心臟組織進行冰凍切片制作，然后采用熒光顯微鏡觀察各組大鼠梗死心肌組織中EGFP蛋白的表達；然后將60只SD大鼠隨機分為3組：Sham組、MI-EGFP組及 MI-shPHD2-E

3、GFP組。EGFP-MI組、MI-shPHD2-EGFP組大鼠分別經(jīng)尾靜脈注入PEI/MB/EGFP復合物、PEI/MB/shPHD2-EGFP混合物；同時對MI-EGFP組、MI-shPHD2-EGFP組大鼠采用Sintron2000超聲基因轉染治療儀輻照大鼠心前區(qū)，輻照條件：2.0W/cm2、3min、20％DC、1MHZ。Sham組大鼠經(jīng)尾靜脈注射入相同量的0.9%Nacl溶液。大鼠在轉染4周后處死，然后進行RT-PCR及West

4、ern-blot分別檢測心肌梗死及缺血邊緣區(qū)PHD2、HIF-1α及VEGF的mRNA和蛋白表達水平；免疫組織化學(Immunohistochemistry，IHC)染色法檢測心肌梗死及缺血邊緣區(qū)的HIF-1α、VEGF的表達及微血管密度(Microvessel density，MVD)；Masson染色檢測MI區(qū)域面積百分比。分別于術前一周及超聲轉染治療后4周行超聲心動圖檢測各組大鼠的左室收縮功能。
　　結果:①熒光顯微鏡觀察顯

5、示，高倍鏡下Plasmid組見個別陽性細胞表達，Plasmid+US組見數(shù)個陽性細胞表達，Plasmid+UTMD組見多個陽性細胞表達；與Plasmid+US組比較，Plasmid+UTMD組基因轉染效率較高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。② RT-PCR顯示 MI-shPHD2-EGFP組PHD2 mRNA表達最低，而HIF-1α及下游促血管生成因子mRNA表達最高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Western-blot顯示M

6、I-shPHD2-EGFP組PHD2蛋白表達最低，而HIF-1α及下游促血管生成因子蛋白表達最高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）③與MI-EGFP組相比，免疫組織化學染色顯示MI-shPHD2-EGFP組HIF-1α、VEGF表達均增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。④與MI-EGFP組相比，MI-shPHD2-EGFP組微血管密度增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。⑤心肌梗死后左室擴大，室壁變薄，與 MI-EGFP組相比，

7、MI-shPHD2-EGFP組心肌梗死面積減小；同時與MI-EGFP組相比，MI-shPHD2-EGFP組分泌膠原相對較少；⑥術前各組心功能無明顯差異，于術后4周與MI-EGFP組比較，MI-shPHD2-EGFP組LVEF、LVFS均增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結論:超聲聯(lián)合微泡破壞能顯著增加EGFP轉染大鼠缺血心肌組織，且PHD2-shRNA能夠抑制PHD2基因表達，促進HIF-1α及下游促血管生成因子基因表