三碘甲狀腺原氨酸減輕七氟醚神經毒性的機制研究.pdf

1、七氟醚是臨床麻醉中常用的一種吸入性麻醉藥，因起效迅速，可控性好，氣道刺激性小等優(yōu)點被廣泛應用于小兒麻醉。最近的研究表明常用的吸入全麻藥暴露對中樞神經系統(tǒng)均有不同程度的毒害作用，主要表現為學習記憶等認知功能的下降。處于發(fā)育期和退行性改變期的中樞神經系統(tǒng)對全麻藥的毒性尤為敏感。處于發(fā)育期的兒童暴露于吸入麻醉藥后，在其成長過程中會出現行為改變及精神癥狀，一項臨床回顧性研究表明小于四歲的小兒暴露于麻醉和手術會增加他們發(fā)育中的閱讀、寫作和數學計算

2、能力障礙的風險。動物實驗研究也表明長時間高濃度吸入七氟醚損害發(fā)育中的腦細胞，還可能導致遠期的神經認知功能障礙。在老年患者，術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)的發(fā)生率顯著高于實施同類手術麻醉的青壯年患者，且研究表明，吸入麻醉藥暴露可加重中樞神經退行性改變，致原有認知功能障礙加重。
　　最近的統(tǒng)計表明，美國每年約有數以百萬計的患兒需要手術和麻醉，如何防治吸入性全麻藥物如

3、七氟醚對于發(fā)育期大腦的神經毒性作用，已經成為近年來眾多臨床醫(yī)生和科學工作者共同探討的話題之一。目前由于七氟醚等全麻藥物的作用機理及其對發(fā)育期大腦的神經毒性未能完全闡明，大部分的研究都是集中在臨床前的動物水平。加之臨床研究的可行性難度較大，所以對于全麻藥物中樞神經毒性防治的研究還處于探索的初步階段。而且大多是來自體外的非生理性激素或藥物，防治效果也并不確切。甲狀腺激素(TH)是人和動物正常生長發(fā)育必需的一類激素，在大腦的發(fā)育、分化、功能的

4、維持中起著重要作用，可激活mTOR等信號轉導通路，影響基因轉錄與蛋白質翻譯，調控神經元增殖、突觸的發(fā)育成熟，改善學習記憶等認知功能。在新生時期，也是大腦發(fā)育的關鍵時期。麻醉劑及其代謝產物可能對甲狀腺的功能狀態(tài)產生影響，干擾甲狀腺激素的分泌。本實驗擬觀察TH對七氟醚麻醉后新生大鼠成年后認知功能的影響及大腦海馬的神經元顯微結構、突觸后密度蛋白-95(PSD-95)、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體亞基2A與2B(NR2A/NR2B)表

5、達的變化，從認知功能障礙相關機制的角度探討七氟醚中樞神經系統(tǒng)毒性的發(fā)生及防治機制，為全麻藥物神經毒性的防治提供新的思路。
　　目的:
　　通過曠場實驗(OFT)、糖水偏好實驗(SPT)、高架十字迷宮實驗(EPMT)、水迷宮實驗(WMT)等行為學實驗，觀察新生大鼠七氟醚麻醉及T3干預后成年期大鼠認知功能和情緒的改變;通過原位缺口末端標記法(TUNEL)觀察大鼠海馬區(qū)細胞凋亡情況;通過Nissl染色方法觀察海馬CA1及CA3區(qū)神

6、經元的密度;應用溴脫氧嘧啶(BrdU)標記技術標記大鼠海馬齒狀回(DG)區(qū)新增殖細胞以觀察神經元增殖情況;應用高爾基銀染色技術觀察大鼠成年時期海馬區(qū)神經元的形態(tài)學改變;Western Blot檢測大鼠海馬區(qū)NMDA受體亞基NR2A、NR2B及其錨定蛋白PSD-95的表達;研究和探討圍麻醉期三碘甲狀腺原氨酸(T3)的使用能否減輕七氟醚對新生大鼠大腦的神經毒性作用及其機制。
　　方法:
　　雌性SD大鼠處鼠5只，體重約180～2

7、20 g，成年雄性SD大鼠2只，雌鼠成功交配后自然分娩，待新生鼠出生后7 d(P7)進行實驗。每只母鼠的子鼠隨機分為生理鹽水(NS)組，七氟醚(SEV)組和T3組，組內雌雄各半。NS組腹腔注射5 ml/kg生理鹽水（與T3組等體積/體重比），SEV組于麻醉前0.5 h腹腔注射5 ml/kg生理鹽水，T3組麻醉前0.5 h腹腔注射T3100μg/kg，每組均連續(xù)注射3d，每次間隔24 h。首次給藥0.5 h后將SEV組和T3組新生鼠放入自

8、制的22 cm×13cm×12 cm透明有機玻璃箱內，箱底鋪鈉石灰，箱內持續(xù)給予1 L/min流量的七氟醚與空氣的混合氣體，出口處連接麻醉氣體監(jiān)測儀確保箱內七氟醚的濃度維持在2％左右，持續(xù)麻醉6h后結束。NS組同樣的裝置給予1 L/min流量的空氣6h。整個箱子放在恒溫板上，溫度37.0～38.0℃。且監(jiān)測新生鼠呼吸、皮膚及口唇黏膜顏色，整個過程無呼吸抑制等異常情況發(fā)生。待麻醉結束后6h各組隨機取3只新生鼠，斷頭取腦后制備石蠟切片，后行

9、TUNEL染色計算DG區(qū)和SVZ區(qū)TUNEL陽性細胞密度。另麻醉結束后當天每組隨機取5只新生鼠腹腔注射BrdU(50 mg/kg)，連續(xù)注射7d后斷頭取腦行免疫熒光染色計算DG區(qū)BrdU與DCX、GFAP雙標個數與BrdU單標的比例。余飼養(yǎng)至21d時斷奶，繼續(xù)飼養(yǎng)至25 d進行行為學實驗。將各組大鼠隨機分為兩批，第一批進行WMT和EPMT。第二批進行OFT和SPT。第一批大鼠，每組隨機取13只大鼠進行連續(xù)3天WMT，休息1天后進行EPM

10、T。第二批大鼠從P25開始進行連續(xù)3天OFT，P28開始連續(xù)三天進行SPT。行為學結束后，每組隨機取5只大鼠(1～2只/母鼠)過量麻醉處死，取大腦組織固定后制備冰凍切片行Nissl染色觀察海馬CA1及CA3區(qū)神經細胞密度;每組隨機取3只大鼠過量麻醉后，快速取大腦行高爾基銀染色，分別觀察海馬CA1、CA3區(qū)錐體細胞超微結構（樹突分支數目、樹突總長度以及空間分布）;在麻醉結束后6 h(P7)、P15、P30，各組隨機取5只（1只/母鼠）大鼠

11、的腦組織在冰面上快速分離，獲得海馬區(qū)組織行Western Blot檢測NR2A、NR2B，及其錨定蛋白PSD-95蛋白表達情況。
　　結果:
　　1.所有七氟醚吸入麻醉的新生鼠麻醉及蘇醒過程平穩(wěn)，無呼吸抑制等異常情況出現，給藥后的9天內，體重變化趨勢組間無顯著性差異(P＞0.05)。SEV組和T3組各有一只體重偏低的子鼠（分別為21 g，23 g）不再參與后繼的實驗。
　　2.麻醉結束后6h，與NS組相比較，SEV組D

12、G區(qū)、SVZ區(qū)TUNEL陽性細胞密度均顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01及P＜0.05)，而T3組與NS組比較，DG區(qū)和SVZ區(qū)的TUNEL陽性細胞密度均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。P15時，SEV組子鼠DG區(qū)BrdU/DCX、BrdU/GFAP雙標的陽性細胞數目與BrdU陽性細胞數目的比值均低于對照組(P＜0.05)，T3組BrdU/GFAP雙標細胞個數與BrdU陽性細胞數目的比值高于SEV組(P＜0.05)，T3組與NS組比

13、較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。七氟醚可減少大腦中神經干細胞的增殖，而T3可以降低七氟醚對神經干細胞增殖的影響。
　　3.P25～P30，SEV組大鼠表現為學習記憶能力的減退，以及一定程度的抑郁和焦慮樣情緒改變，與SEV組比較，T3組大鼠的焦慮和抑郁樣情緒以及學習能力均有明顯改善。具體表現為:和NS及T3組相比，SEV組大鼠水迷宮的逃避潛伏期顯著延長（P＜0.01及P＜0.05），NS組和T3組相比較逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學意

14、義(P＞0.05);在SPT中，SEV組糖水飲用率較NS組顯著降低(P＜0.01)，而T3組與NS組糖水飲用率相比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。P25～P27時，OFT中，SEV組大鼠在中央格區(qū)的停留時間較其他兩組顯著延長(P＜0.05)，T3組在中央格區(qū)的停留時間與NS組比較，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。P30時，EPMT中，三組大鼠在開放臂（open arms）停留的時間，組間比較均無顯著性差異(P＞0.05)。這些行為學結

15、果表明，新生鼠七氟醚麻醉可致其成年期的學習記憶功能損害，并在一定程度上有焦慮和抑郁樣復雜情緒表現，T3在圍麻醉期的應用可以改善七氟醚對新生大鼠成年期學習記憶能力的損害和情緒的影響。
　　4.P30時，SEV組在CA3區(qū)細胞密度顯著低于NS組及T3組（P＜0.01），NS組及T3組相比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);而CA1區(qū)神經細胞密度，三組間比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。P30時，SEV組和T3組海馬CA3區(qū)錐體

16、神經元樹突總長度均顯著短于NS組(P＜0.001，P＜0.05)，且SEV組在CA3區(qū)的錐體神經元樹突分支數目較對照組顯著減少(P＜0.01)，而T3組與NS組樹突分支數比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);在CA1區(qū)，SEV組錐體神經元的樹突總長度較NS組顯著減少(P＜0.05)，T3組與NS組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但CA1區(qū)錐體神經元樹突分支數目，三組間比較均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。該數據表明，七氟醚對新生

17、大鼠海馬區(qū)神經元的發(fā)育有損害作用，可導致CA1和CA3區(qū)錐體神經元不同程度的發(fā)育障礙，而T3在圍麻醉期的使用可以減輕其對海馬錐體神經元的毒性作用。
　　結論:
　　幼鼠在新生時期，七氟醚麻醉可導致中樞神經損傷，出現海馬區(qū)神經細胞凋亡增多，影響海馬DG區(qū)的細胞增殖，主要是新生的未成熟神經元和星形膠質細胞的增殖;大鼠成年期海馬CA3區(qū)神經細胞減少，CA1及CA3區(qū)錐體神經元發(fā)育障礙;成年后的神經行為學出現異常，表現為焦慮和抑郁的