長鏈非編碼RNA H19在血管重塑中的作用及其機制研究.pdf

1、目的:缺血性疾病是當今導致人類死亡主要病因，盡管血管外科開放手術及腔內(nèi)治療已取得長足進展，很大程度改善了患者預后，但其遠期療效仍然令人堪憂，因為幾乎所有患者都難以避免因血管重塑導致的再狹窄發(fā)生。由此探究血管重塑機制具有重要意義。但自傳統(tǒng)血管外科開放手術時代至今日的腔內(nèi)時代，血管負性重塑問題一直是臨床治療的難點，其甚至被稱作為“血管外科醫(yī)生的挑戰(zhàn)”。血管負性重塑的主要機制是，生理狀態(tài)下靜默的血管平滑肌細胞被活化，導致血管平滑肌細胞異常增殖

2、，進而新生內(nèi)膜形成。因此，探索血管平滑肌細胞增殖的病理生理學機制是解決血管負性重塑問題的關鍵。近年來，研究證實微小RNA(microRNAs，miRNA)、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)等非編碼RNA對生理狀態(tài)維持和疾病發(fā)生發(fā)展均有重要作用，逆轉了過去認為非編碼RNA無用的錯誤認知。研究表明尤其是LncRNA、miRNA具有很強的基因調(diào)控功能，其參與轉錄、翻譯及蛋白降解過程。長鏈非編碼RNAH19

3、(LncRNAH19)發(fā)現(xiàn)于1984年，于1992年證明人類亦存在該基因，2007年進一步發(fā)現(xiàn)LncRNAH19是miR-675的前體基因。LncRNAH19多在胚胎或腫瘤組織中高表達，因此被稱作“癌基因”。新近研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA的功能具有細胞/組織特異性，因此本研究旨在探討LncRNAH19在血管平滑肌細胞中的功能及其在血管重塑中的角色。
　　方法:為了研究LncRNAH19與血管負性重塑的關系，我們建立了大鼠頸動脈球囊損傷

4、模型，并檢測了負性重塑的模型血管中LncRNAH19和miR-675的表達。為進一步研究LncRNA H19的功能，我們于人胸主動脈平滑肌細胞系T/GHA-VSMC中過表達LncRNAH19，由于LncRNAH19可內(nèi)源性產(chǎn)生miR-675，因此他們提出了LncRNA H19的生物學功能是由產(chǎn)生miR-675介導的。為了驗證這一假說，我們運用生物信息學軟件RNAhybrid和DIANA分析miR-675可能作用的靶基因，并用雙螢光素酶報

5、告基因分析法加以驗證。為了進一步確定LncRNA H19的生物學功能是依賴于miR-675的，我們進行了回復實驗，即在LncRNA H19過表達的T/G HA-VSMC細胞中沉默miR-675，觀察LncRNA H19對血管平滑肌細胞的生物學功能是否隨著miR-675的沉默而變化。慢病毒感染和miRNA轉染用于調(diào)控LncRNA H19和miR-675表達;T/G HA-VSMC增殖能力
　　通過CCK-8實驗、Brdu摻入實驗及檢

6、測PCNA評價;運用流式細胞儀檢測細胞周期分布;蛋白質免疫印跡法檢測蛋白表達量變化，以實時熒光定量PCR檢測各類RNA的表達情況。實驗結果均用均值±標準差表示，兩組間比較運用t檢驗，多組間兩兩比較使用單因素方差分析。當P＜0.05時認為有顯著統(tǒng)計學差異。統(tǒng)計學處理軟件運用SPSS23.0和GraphPad Prism7完成。
　　結果:成功建立大鼠頸動脈球囊損傷模型，術后1周、3周可見新生內(nèi)膜逐漸增厚;原位雜交法檢測發(fā)現(xiàn)LncRN

7、A H19和miR-675表達量隨著新生內(nèi)膜增厚而增加，Pearson相關分析證實LncRNA H19和miR-675表達量均與新生內(nèi)膜厚度正相關。CCK-8實驗證實過表達LncRNAH19后，顯著促進了T/G HA-VSMC細胞增殖，而運用蛋白質免疫印跡法檢測細胞增殖指標PCNA的表達，亦發(fā)現(xiàn)過表達LncRNA H19后顯著上調(diào)了PCNA的表達，而Brdu摻入實驗也發(fā)現(xiàn)，LncRNA H19過表達組其增殖細胞數(shù)量顯著增加，進一步分析細

8、胞周期，發(fā)現(xiàn)過表達LncRNA H19促使細胞S期、G2/M期細胞比例增加;綜上證明LncRNA H19具有促進血管平滑肌細胞增殖功能。此外，生物信息學預測結果提示PTEN可能是miR-675的靶基因，依據(jù)生物信息學預測得到的結合位點構建雙螢光素酶質粒，發(fā)現(xiàn)miR-675 mimics顯著抑制了野生型質粒的螢光素酶活性，而對突變型質粒的螢光素酶活性無顯著抑制效應。進行回復實驗時，RT-qPCR證實于過表達LncRNA H19的T/G H

9、A-VSMC細胞中轉染miR-675抑制劑miR-675 inhibitor，可顯著降低miR-675的表達，但不影響LncRNA H19的表達，在此基礎上檢測PTEN、p-AKT、PCNA的表達量變化，結果證實LncRNA H19對上述蛋白的調(diào)控作用可隨著miR-675的抑制而被削弱。
　　結論:LncRNA H19及miR-675表達量與新生內(nèi)膜形成厚度正相關;LncRNAH19具有促進血管平滑肌細胞增殖功能;LncRNA H