金納米棒介導的靶向DC沉默 IDO聯(lián)合Flt3-L體內擴增DC技術治療小鼠肺癌的研究.pdf

1、目的：
　　樹突狀細胞（Dendritic Cell，DC）是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強大的專職抗原提呈細胞，成熟的DC能有效激活初始型T細胞，是參與機體免疫應答的重要細胞，但DC能產生一些如吲哚胺2,3-雙加氧酶（Indoleamine2,3-deoxygenase,IDO）的重要的免疫負調控分子，它可以使腫瘤逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，改變腫瘤的侵襲和轉移的能力，從而影響DC疫苗臨床治療的效果。本研究應用納米技術構建能靶向DC沉默IDO的新型

2、金納米棒（Gold nanorod，GNR）導入系統(tǒng)GNR-MUA-PEI-Man/siIDO，探討其對DC的靶向性、siIDO沉默效應、評估該納米靶向系統(tǒng)聯(lián)合Flt3-L體內擴增DC技術對小鼠肺癌的治療效果。
　　方法：
　　1.GNR-MUA-PEI-Man系統(tǒng)的創(chuàng)建：借鑒經典的金納米棒的晶種子溶液生長法合成本實驗所需金納米棒，并對金納米棒進行進一步的功能化修飾。通過透射電鏡觀察金納米棒修飾前后大小、分散度；酶標儀檢測紫

3、外光譜，觀察其局域表面等離子共振效應；并通過核磁共振檢測修飾后金納米棒表面的化學結構式。
　　2.通過CCK8試劑檢測金納米棒修飾前后對細胞的毒性。
　　3.金納米棒與siIDO按照不同的質量比連接，通過凝膠阻滯實驗觀察結合情況。4.流式細胞技術觀察GNR-MUA-PEI-Man/cy3-siGAPDH對DC的靶向轉染效率，并確定最佳轉染濃度和轉染時間。
　　5.Q-PCR檢測GNR-MUA-PEI-Man/siIDO

4、對DC的IDO沉默效果。
　　6.將GNR-MUA-PEI-Man/siGAPDH尾靜脈注射至C57BL/6小鼠體內，48h后取其心肝脾肺腎制成冰凍切片，觀察體內靶向作用。
　　7.將GNR-MUA-PEI-Man/siIDO尾靜脈注射至C57BL/6小鼠體內，聯(lián)合Flt3-L體內擴增DC，治療小鼠肺癌，觀察治療效果。
　　8.取各實驗組小鼠脾臟細胞，檢測Flt3-L體內擴增DC的效果及T細胞的凋亡情況。
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5、.磁珠分選出小鼠脾臟CD11c+DC，檢測 DC的成熟度以及 GNR-MUA-PEI-Man/IDO的體內IDO沉默效果。
　　10.磁珠分選出各實驗組小鼠脾臟CD8+T細胞和CD4+T細胞，檢測細胞毒性T細胞的殺傷作用，及CD4+T細胞的增殖能力。
　　結果：
　　1.功能化修飾后的金納米棒（GNR-MUA-PEI-Man）的紫外可見吸收峰發(fā)生明顯紅移至810nm，透射電子顯微鏡下觀察到其大小未見明顯改變、分散度良好

6、，核磁共振成功檢測到其表面的甘露糖六元雜環(huán)結構。
　　2.GNR-MUA-PEI-Man對細胞的毒性明顯降低，生物相容性、生物安全性明顯提高。
　　3.凝膠阻滯實驗表明GNR-MUA-PEI-Man與siIDO的質量比在2:1時，兩者剛好全部結合。
　　4.流式檢測表明GNR-MUA-PEI-Man與siIDO的比例為5:1時，轉染24h后，對DC的轉染效率達最高，為70％。
　　5.Q-PCR檢測GNR-MUA

7、-PEI-Man/siIDO體外轉染DC細胞48h后，對IDO的沉默效率可達71.2%，且沉默IDO后，可明顯促進DC的成熟度。
　　6.冰凍切片結果顯示，GNR-MUA-PEI-Man/Cy3-siGAPDH尾靜脈注射48h后，熒光物質主要蓄積在富含DC等單核-巨噬細胞的脾臟、肝臟內；余組織器官內未見明顯蓄積。
　　7.將GNR-MUA-PEI-Man/siIDO尾靜脈注射至C57BL/6小鼠體內能有效地沉默體內DC ID

8、O的表達，聯(lián)合Flt3-L體內擴增DC，可明顯抑制肺癌的增長。
　　8.通過本研究建立的GNR-MUA-PEI-Man/siIDO下調小鼠體內DC的IDO表達后，小鼠體內的T細胞的凋亡減少，細胞毒性T細胞的殺傷作用增強，CD4+T細胞的增殖能力增加。
　　結論：
　　1.本研究構建的GNR-MUA-PEI-Man基因載體能有效地靶向轉染siRNA進入DC，并沉默靶分子。
　　2.GNR-MUA-PEI-Man/s