乙醇對原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細胞影響的掃描電鏡及CYP2E1、iNOS和NSE表達的研究.pdf

1、背景與目的:
　　 乙醇對大腦有神經(jīng)毒性作用,進入神經(jīng)系統(tǒng)后可對細胞產(chǎn)生直接毒性作用。乙醇能引起神經(jīng)行為的改變,隨著血中乙醇濃度的升高,人的注意力、判斷力及辨別力均會不同程度受損,而可能引發(fā)各種刑事案件和民事案件,因此很有必要對乙醇與機體的作用進行深入的研究。本研究用不同濃度乙醇作用原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細胞后,采用倒置顯微鏡、HE染色及掃描電鏡觀察皮質(zhì)神經(jīng)細胞形態(tài)的改變；采用免疫組化SP法,研究皮質(zhì)神經(jīng)細胞CYP2E1、iNOS

2、和NSE表達的時序性變化,探討它們之間的相互關(guān)系以及參與腦損傷的機理。
　　 方法:
　　 1、采用清潔級新生SD大鼠(出生后24 h內(nèi)),分離大腦皮質(zhì),進行體外培養(yǎng),采用免疫組化SP法進行皮質(zhì)神經(jīng)細胞的純度鑒定,選擇皮質(zhì)神經(jīng)細胞純度高、生長狀態(tài)良好的細胞隨機分為對照組及低、中和高劑量組。低、中和高劑量組在培養(yǎng)液中加入無水乙醇,使培養(yǎng)液中乙醇濃度分別為0.5 g／L、1.5 g／L和3.0 g／L；對照組在培養(yǎng)液中加入等

3、量生理鹽水。分別處理皮質(zhì)神經(jīng)細胞30min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h。
　　 2、通過HE染色法觀察不同濃度乙醇作用下、不同時間點原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細胞形態(tài)的改變。
　　 3、通過掃描電鏡觀察不同濃度乙醇作用下、不同時間點原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細胞形態(tài)的改變。
　　 4、采用免疫組化SP法研究不同濃度乙醇作用下、不同時間點原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細胞CYP2E1、iNOS和NSE表達的變化。

4、
　　 5、統(tǒng)計分析:所有數(shù)據(jù)均用(x)±s表示,用SPSS12.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,采用LSD法進行兩兩比較,檢驗水準a=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1、大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細胞的原代培養(yǎng):皮質(zhì)神經(jīng)細胞在培養(yǎng)第9 d分化成熟,倒置顯微鏡下可見細胞胞體飽滿,折光性強,胞核位于細胞中央或偏于一側(cè),胞核及核仁清晰可見,細胞突起長度明顯增長,突起粗大并交織成網(wǎng)狀。
　　 2、大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細胞的純度鑒

5、定:NSE免疫細胞化學染色后,陰性對照可見細胞漿及突起呈淡藍色,陽性反應可見細胞漿及突起呈棕黃色。計算出每個視野中陽性細胞數(shù)與細胞總數(shù)的平均比值為90％,即神經(jīng)細胞純度為90％。
　　 3、乙醇作用后皮質(zhì)神經(jīng)細胞倒置顯微鏡下的表現(xiàn):0.5 g／L乙醇作用后,各時間點細胞形態(tài)改變與對照組基本相同。1.5 g／L乙醇作用8 h后,細胞形態(tài)發(fā)生改變,細胞呈梭形或長梭形,胞漿內(nèi)可見圓形空泡。3.0 g／L乙醇作用后,隨著乙醇濃度和作用時

6、間增加,細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,細胞腫大變圓,細胞漿內(nèi)圓形空泡增多,細胞突起變短明顯,細胞核腫大或消失,細胞間連接消失。
　　 4、乙醇作用后皮質(zhì)神經(jīng)細胞HE染色結(jié)果:0.5 g／L乙醇作用后,各時間點細胞的形態(tài)改變與對照組基本相同。1.5 g／L乙醇作用8 h后,細胞形態(tài)發(fā)生改變,可見細胞胞體腫大、變圓,細胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡,胞核不規(guī)則淡染。3.0 g／L乙醇作用后,隨著乙醇濃度和作用時間的增加,細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,細胞腫大變圓,

7、細胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量空泡；部分細胞胞體變小、深染、或呈三角形,細胞漿紅染加深,細胞核小而深染,核仁不明顯,細胞間連接消失。
　　 5、乙醇作用后皮質(zhì)神經(jīng)細胞掃描電鏡觀察結(jié)果:0.5g／L乙醇作用后,各時間點細胞形態(tài)改變與對照組基本相同。1.5 g／L乙醇作用8 h后,細胞形態(tài)發(fā)生改變,部分細胞胞體呈梭形、長梭形或不規(guī)則形,突起變短明顯；少數(shù)細胞胞體表面的樹突棘形態(tài)發(fā)生改變,胞體局部失去與其他細胞的連接。3.0 g／L乙醇作用后,隨著

8、乙醇濃度和作用時間的增加,細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,細胞胞體腫大變圓,部分細胞呈不規(guī)則形,突起變短；隨著作用時間增加,表面呈凹陷狀、不規(guī)則形的細胞逐漸增多,突起變短明顯,部分細胞樹突棘的形態(tài)發(fā)生改變；最后大部分細胞塌陷呈平鋪狀,細胞突起消失,細胞之間的連接消失。
　　 6、乙醇作用后皮質(zhì)神經(jīng)細胞內(nèi)CYP2E1、iNOS和NSE的表達結(jié)果:(1)CYP2E1的表達結(jié)果:對照組皮質(zhì)神經(jīng)細胞內(nèi)CYP2E1只有輕度表達；0.5 g／L乙醇作

9、用后皮質(zhì)神經(jīng)細胞內(nèi)CYP2E1的表達稍有增強；1.5 g／L乙醇作用后,皮質(zhì)神經(jīng)細胞內(nèi)CYP2E1表達逐漸增強,2 h時CYP2E1表達開始增強,12 h時CYP2E1表達最強,24h時CYP2E1表達仍高于正常；3.0 g／L乙醇作用后,皮質(zhì)神經(jīng)細胞內(nèi)CYP2E1表達逐漸增強,1 h時CYP2E1表達開始增強,8 h時CYP2E1表達最強,隨后表達逐漸下降,24 h時CYP2E1表達仍高于正常。(2)iNOS的表達結(jié)果:對照組皮質(zhì)神經(jīng)

10、細胞內(nèi)iNOS只有極輕度表達；0.5 g／L乙醇作用后皮質(zhì)神經(jīng)細胞內(nèi)iNOS的表達稍有增強；1.5 g／L乙醇作用后,皮質(zhì)神經(jīng)細胞內(nèi)iNOS表達逐漸增強,2 h時iNOS表達開始增強,12 h時iNOS表達最強,隨后表達逐漸下降,24 h時iNOS表達仍高于正常；3.0 g／L乙醇作用后,皮質(zhì)神經(jīng)細胞內(nèi)iNOS表達逐漸增強,1 h時iNOS表達開始增強,8 h時iNOS表達最強,隨后表達逐漸下降,24 h時iNOS表達仍高于正常。(3)

11、NSE的表達結(jié)果:對照組皮質(zhì)神經(jīng)細胞內(nèi)NSE呈強陽性表達；0.5 g／L乙醇作用后皮質(zhì)神經(jīng)細胞內(nèi)NSE的表達稍減弱；1.5 g／L乙醇作用后,皮質(zhì)神經(jīng)細胞內(nèi)NSE表達逐漸下降,2 h時NSE表達開始下降,12 h時NSE表達最弱；3.0 g／L乙醇作用后,皮質(zhì)神經(jīng)細胞內(nèi)NSE表達下降比較快,1 h時NSE表達開始下降,8 h時NSE表達最弱。
　　 結(jié)論:
　　 1、不同濃度乙醇作用原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細胞后,倒置顯微鏡