LIN28A在浸潤性乳腺癌中的表達調(diào)控及其功能機制的研究.pdf

1、目的：乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，我國乳腺癌的發(fā)病率以每年3％的速度遞增，成為威脅女性最常見的惡性腫瘤。上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程。LIN28作為高度保守的RNA結(jié)合蛋白，在多種腫瘤中存在廣泛的異位表達，且有研究發(fā)現(xiàn)，LIN28過度表達是腫瘤患者不良預后的強大預測指標。本文通過研究 LIN28A在浸潤性乳腺癌中的表達以及LIN28A對乳腺癌細胞的影響，探討LIN28

2、A誘導乳腺癌發(fā)生EMT以及對乳腺癌細胞增殖、侵襲和凋亡調(diào)控機制。
　　方法：
　　1首先利用實時定量PCR對浸潤性乳腺癌組織中LIN28A、OCT4、E-cadherin和Vimeatin進行檢測，明確它們的表達情況，其次利用免疫組織化學法，分析LIN28A的表達與臨床病理參數(shù)之間的關系，以期明確在浸潤性乳腺癌中 LIN28A與 EMT相關因子及 OCT4的關系，最后通過TUNNEL實驗檢測石蠟組織切片中細胞凋亡的情況，探究

3、 LIN28A對細胞凋亡的影響。
　　2體外實驗通過構(gòu)建穩(wěn)定表達 LIN28A的 MCF-7細胞系，研究LIN28A對乳腺細胞特性的影響，其中包括流式細胞術(shù)檢測病毒轉(zhuǎn)染效率， Transwell實驗檢測細胞侵襲和遷移能力，克隆形成實驗檢測細胞增殖能力，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和細胞周期情況。最后，通過Real-time和Western-blot實驗檢測各相關基因及蛋白的表達情況，明確乳腺癌細胞中LIN28A對癌細胞的調(diào)控機制。

4、>　　結(jié)果：1 Real-time實驗結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，在浸潤性乳腺癌組織中LIN28A、OCT4、Vimeatin高表達，E-cadherin低表達。并且LIN28A與OCT4表達正相關（R=0.332，P＜0.05），Vimeatin表達正相關（R=0.38， P＜0.05），與E-cadherin表達負相關（R=-0.34，P＜0.05），E-cadherin與Vimeatin表達也成負相關（R=-0.353，P＜0.05

5、）；2免疫組織化學實驗表明，LIN28A表達與浸潤性乳腺癌腫瘤的大小、病理分期、分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移有關，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。并且 LIN28A與OCT4表達正相關（R=0.423，P＜0.05），與Vimeatin表達正相關（R=0.364， P＜0.05），與 E-cadherin表達負相關（R=-0.533，P＜0.05），E-cadherin與Vimeatin表達也成負相關（R=-0.453，P＜0.05）。

6、Kaplan-Meier生存曲線分析表明，患者低LIN28A表達水平存活顯著長于那些高LIN28A表達水平，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.021），表明，在浸潤性乳腺癌中，LIN28A與患者的不良臨床預后相關；3 TUNNEL實驗顯示，高表達LIN28A的乳腺癌組織中，細胞凋亡減少；4 Puromycin篩選出穩(wěn)定表達 LIN28A的MCF-7細胞株，流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)感染率，用400μl病毒液感染293T細胞，control-pSBbi-G

7、P和LIN28A-pSBbi-GP的感染效率為13.1%、12.6%。800μl病毒液感染293T細胞，control-pSBbi-GP和LIN28A-pSBbi-GP的感染效率為20.1%、19.5%。由于轉(zhuǎn)染效率太低，故用病毒原液感染MCF-7細胞， control-pSBbi-GP和 LIN28A-pSBbi-GP的感染效率為29.6%、24.8%。；5用Real-time和Western-blot檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)后LIN28A的表達情況

8、，首先Real-time檢測LIN28A和let-7a的表達，從實驗結(jié)果可以看出，與control-pSBbi-GP和parental相比，LIN28A-pSBbi-GP中LIN28A mRNA表達升高，而let-7a mRNA表達降低（P＜0.05）。隨后通過Western-blot實驗檢測LIN28A蛋白水平的表達，同樣是與control-pSBbi-GP和parental相比，LIN28A-pSBbi-GP中LIN28A表達升高（

9、P＜0.05）；6克隆形成實驗研究細胞增殖的變化，本實驗結(jié)果顯示，parental組、control-pSBbi-GP組和 LIN28A-pSBbi-GP組的克隆數(shù)分別為38.20±2.02、44.55±2.67和102.65±9.87，與parental組和control-pSBbi-GP組相比，LIN28A-pSBbi-GP克隆數(shù)顯著增加（P＜0.05），control-pSBbi-GP組與 parental組相比，差異無統(tǒng)計學意義

10、（P＞0.05），提示過表達LIN28A基因可以促進細胞增殖；7 Transwell實驗結(jié)果顯示，在乳腺癌 MCF-7細胞中，與 parental組和control-pSBbi-GP組相比，LIN28A-pSBbi-GP組遷移和侵襲到下室的細胞數(shù)明顯增加（P＜0.05），提示過表達LIN28A基因可以促進細胞的遷移和侵襲能力；8 FCM檢測細胞凋亡和細胞周期的變化，結(jié)果顯示，與parental組和control-pSBbi-GP組相比，

11、LIN28A-pSBbi-GP組細胞早期凋亡率顯著降低（P＜0.05），并且，過表達LIN28A基因后，G1期細胞減少，S期細胞增多；9 Real-time和 Western-blot實驗結(jié)果表明，與 parental組和control-pSBbi-GP組相比，LIN28A-pSBbi-GP組MCF-7細胞Snail和Slug表達上調(diào)，CyclinD1和eIF4E表達上調(diào)，Bcl-XL表達上調(diào)，這表明過表達LIN28A可能通過抑制let

12、-7誘導乳腺癌細胞增殖，抑制細胞凋亡；10進一步研究LIN28A與OCT4的關系，通過Real-time和Western-blot實驗發(fā)現(xiàn)，過表達LIN28A后，OCT4表達增加，E-cadherin表達減少，Vimtern表達增加，提示，LIN28A也可以通過誘導OCT4的表達，促進乳腺癌EMT的進程。
　　結(jié)論：
　　1 LIN28A在浸潤性乳腺癌中的表達與 E-cadherin的表達負相關與Vimentin的表達正相關

13、，提示LIN28A可能通過EMT促進了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，并且LIN28A高表達是患者不良預后的獨立因素。
　　2通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)在 MCF-7細胞中過表達 LIN28A，我們發(fā)現(xiàn)LIN28A過表達可促進細胞的增殖，抑制細胞的凋亡，使細胞阻滯在S期，同時，通過檢測 let-7相關的靶基因，發(fā)現(xiàn) LIN28A可以通過LIN28/Let-7/HMGA2/Slug、Snail/E-cadherin和LIN28/let-7/BCL