大鼠局灶性腦挫傷后Homer蛋白表達變化.pdf

1、腦是人體的生命中樞，是最易受損的器官。腦損傷在法醫(yī)鑒定工作中很常見，且隨著經濟和交通的迅速發(fā)展，創(chuàng)傷性顱腦損傷的發(fā)生率逐年升高，已經嚴重威脅人們的生命健康。因此關于腦損傷時間、機制、損傷程度的研究就顯得非常重要。Homer蛋白是突觸后密度蛋白家族成員之一，它是聯系突觸內細胞骨架蛋白、信號蛋白的重要物質。最初在神經系統(tǒng)被發(fā)現，它在信號轉導、突觸形成、受體轉運和受體細胞內定位起重要作用。癲癇、高頻刺激、損傷及發(fā)育等興奮性突觸活動可誘導Hom

2、er蛋白表達增加。目前為止，顱腦損傷機制方面的研究很多，其中機制之一是通過代謝性谷氨酸受體（mGluRs）引起細胞內鈣離子釋放導致神經元損傷；有研究發(fā)現，Homer蛋白在代謝性谷氨酸受體引起的神經元損傷中起到重要作用；另有研究發(fā)現，在彌漫性顱腦損傷動物模型中Homer蛋白表達增加，因此有必要利用腦損傷模型，進一步觀察Homer蛋白表達變化規(guī)律，完善Homer蛋白在各種腦損傷模型中的研究，為腦損傷時間推斷法醫(yī)鑒定提供參考依據。
　　

3、 材料與方法：
　　 一、動物模型的制作，分組與對照
　　 雄性Wistar大鼠50只，體重220-250g，由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供。隨機分為10組，其中包括8個實驗組，1個正常對照組，1個假手術組，每組5只大鼠。實驗組采用吳旭等[3]研制的大鼠腦挫傷模型制作方法，制造大鼠局灶性閉合性腦挫傷模型。乙醚吸入預麻醉，大鼠稱重后，2％戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔注射麻醉。正中切開大鼠頂部頭皮，在人字縫前3mm，矢狀

4、縫旁3mm處鉆直徑為5mm的圓形骨窗，保持硬腦膜完好，采用自由落體打擊裝置，以30g重錘從25cm高處落下，打擊暴露的腦組織；假手術組以相同的方法鉆孔，但不進行打擊。術后動物分籠飼養(yǎng)，保持墊料清潔及空氣通暢。于傷后0.5、3、6、12h和1、3、5、7d將大鼠乙醚麻醉后脫頸椎處死。手術取出腦組織，沿冠狀方向將挫傷區(qū)平均分為兩部分，并對損傷周邊區(qū)進行取材、修塊，一份用于免疫組化染色，另一份用于Western blot檢測。對照組和假手術組

5、以同樣方法取相同部位的腦組織作為對照。
　　 二、免疫組織化學染色
　　 腦組織經4％多聚甲醛固定后，水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作5μm厚度切片。采用鏈霉素-生物素法（SP法）進行免疫組化染色，并用蘇木素復染細胞核，具體步驟同試劑盒說明書。Homer單克隆一抗（1:200）稀釋，4℃孵育過夜。染色過程中另以一抗稀釋液替代一抗，作為陰性對照。小鼠來源Homer（D-3）單克隆抗體購自Santa Cruz

6、Biotechnology，小鼠SP免疫組織化學試劑盒（SP-9002）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
　　 三、Western blot檢測
　　 對用于Western blot的腦組織進行裂解、勻漿、離心，提取蛋白并進行蛋白定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉印，5％脫脂牛奶封閉，一抗（1:800稀釋）、二抗（1:5000稀釋）孵育后，DAB顯色。實驗中以GADPH為內參。
　　 實驗結果：
　　

7、一、免疫組織化學染色結果
　　 對照組及假手術組神經元胞漿中可見少量Homer蛋白表達，陽性染色較淡。實驗組中，腦挫傷后0.5h、3h組挫傷周邊區(qū)可見陽性細胞數逐漸增多，胞漿內Homer蛋白表達增多，陽性染色較深；6h、12h、1d組陽性細胞數維持在較高水平，傷后12h組陽性細胞數達到高峰，隨后3d組可見陽性細胞數明顯下降，5d、7d組基本降至基礎水平，并可見陽性細胞染色較淡。
　　 二、Western blot結果

8、r>　　 對照組及假手術組可見少量Homer蛋白表達；腦挫傷后0.5h、3h組可見Homer蛋白表達增加，6h、12h、1d組Homer蛋白表達維持較高水平。12h組達到高峰，隨后3d組下降，5d、7d組降至基礎水平。取損傷后不同時間段條帶的平均光密度值，經統(tǒng)計分析，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　 結論：
　　 本實驗在建立大鼠局灶性閉合性腦挫傷模型的基礎上，應用免疫組織化學染色、Western blot方法