大鼠BDNF基因真核表達及其產物對BMSCs定向誘導分化研究.pdf

1、腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)作為神經生長因子家族成員，與神經系統(tǒng)發(fā)育有著密切關系，不僅對中樞神經元的發(fā)育、增殖分化、存活起重要作用，而且對損傷后神經元的修復與功能重塑也起重要作用。近年來神經生長因子家族一些成員紛紛被克隆并應用于中樞神經系統(tǒng)退行性疾病的防治。 本試驗目的是通過RT-PCR技術及基因克隆的方法，構建含大鼠腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)基因的真核

2、表達載體pEGFP(N1)-BDNF，以重組質粒pEGFP(N1)-BDNF作為外源性基因，與脂質體一起轉染到骨髓基質干細胞(BMSCs)中，通過熒光顯微鏡觀察，并結合免疫熒光化學染色方法鑒定基因工程細胞是否穩(wěn)定表達BDNF蛋白，同時根據免疫細胞化學染色方法鑒定。BMSCs細胞能否在其表達的BDNF蛋白誘導下轉變?yōu)樯窠浖毎蛏窠浤z質細胞。 BDNF真核表達載體pEGFP(N1)-BDNF的構建：從2-3日齡大鼠腦組織中抽提總R

3、NA，應用RT-PCR技術擴增BDNF基因片段，將此片段克隆入PMD-18-T載體，酶切反應鑒定。雙酶切BDNF-T載體和空質粒pEGFP(N1)，將所獲目的片段和線性空載體用T4 DNA連接酶連接，構建真核表達載體pEGFP(N1)-BDNF。并進行酶切反應鑒定及DNA測序。測序結果與GenBank提供的已知序列比較，證明所克隆的BDNF基因從起始密碼子ATG到終止密碼子TAG全長共750bp，與報道的序列完全相同。 pEG

4、FP(N1)-BDNF在BMSCs中的表達：首先進行骨髓基質干細胞(BMSCs)的采集與貼壁法培養(yǎng)，并反復傳代，使BMSCs得到擴增和純化，獲得高純度的BMSCs。然后應用脂質體轉染技術將pEGFP(N1)-BDNF轉染到BMSCs中，對轉染細胞進行熒光顯微鏡觀察及BDNF免疫熒光化學染色鑒定。質粒轉染BMSCs 18h后，在倒置熒光顯微鏡下，pEGFP(N1)-BDNF和pEGFP(N1)空載體組鏡下可見細胞發(fā)出綠色熒光，GFP呈陽性

5、的BMSCs細胞數約為60％。通過BDNF蛋白的免疫熒光化學方法鑒定成功轉染pEGFP(N1)-BDNF組的BMSCs，陽性BMSCs細胞數約為30％，提示BDNF在細胞中表達。轉染的細胞繼續(xù)培養(yǎng)后，通過免疫細胞化學染色結果可以看出，陽性細胞逐漸表達神經元特異性烯醇化酶(NSE)。 結果表明通過基因重組的方法將BDNF基因己克隆到質粒pEGFP(N1)上，采用限制性內切酶酶切和DNA序列分析鑒定表明成功構建成真核表達載體pEG