弓形蟲SAG2、GRA6、GRA7基因的重組表達及應用研究.pdf

1、研究背景與目的：弓形蟲(Toxopasma gondii)是嚴重影響健康的機會致病原蟲。能在人類與家畜之間傳播，呈世界性分布。它可侵犯除健康成熟紅細胞以外的有核細胞，引起多器官組織的病變。對于正常人群，機體免疫力正常，則感染弓形蟲后常為無癥狀帶蟲狀態(tài)，然而對于特殊人群如當患有艾滋病、結核、腫瘤、器官移植后等免疫功能受損或抑制時，弓形蟲就機會性感染引起明顯的臨床癥狀，甚至死亡。若孕婦患有弓形蟲感染可引起胎兒畸形及流產(chǎn)，嚴重者可出現(xiàn)死胎。在

2、家禽之間的傳播導致大量家禽的死亡，造成嚴重的經(jīng)濟損失。因而預防弓形蟲病的發(fā)生，早期診斷弓形蟲病具有很大的臨床價值。然而弓形蟲寄生于宿主細胞內(nèi)，直接取弓形蟲病原體困難，而臨床表現(xiàn)無特異性，單靠臨床診斷非常困難。目前常用的方法有病原學、免疫學和分子生物學，每種方法各有優(yōu)缺點。病原體直接鏡檢是傳統(tǒng)方法，特異性高但容易漏診，不能適應臨床需要。免疫學診斷方法敏感性及特異性高，操作相對便捷，所以應用免疫學方法診斷弓形蟲病更為重要。隨著近幾年分子生物

3、學的發(fā)展，將有診斷價值的弓形蟲抗原分子克隆到原核或真核表達載體，進行表達、純化，從而獲得高純度抗原，特異性高，應用廣泛。 SAG2是表面抗原蛋白，GRA6、GRA7是致密顆粒蛋白，具有較強的抗原性和免疫原性。本研究首先構建了弓形蟲的 RH株 SAG2、GRA6和 GRA7基因的重組質(zhì)粒pGEX-4T-SAG2、pGEX-4T-GRA6和pGEX-4T-GRA7，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21，然后用IPTG體外誘導表達目的蛋白，純

4、化的蛋白作為包被抗原，對358份人源血清進行ELISA檢測，為SAG2、GRA6和GRA7作為人、獸弓形蟲病診斷抗原的研究奠定基礎。
　　方法：1．目的基因的擴增從弓形蟲感染的小鼠腹水中提取RH株的基因組DNA，然后以提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物電泳鑒定純化回收。2．重組質(zhì)粒的構建將PCR產(chǎn)物及載體pGEX-4T分別進行雙酶切(EcoRI、BamHI)，通過回收試劑盒回收酶切片段，將獲取的目的片段與載體進行連接

5、，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli TOP10感受態(tài)細胞。酶切鑒定后送基因公司測序。3.重組質(zhì)粒的表達和純化IPTG體外誘導表達，利用His-bindTM柱柱純化融合蛋白，SDS-PAGE和免疫印跡分析。
　　結果：1. PCR特異地擴增出目的基因，SAG2、GRA6和GRA7擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定，大小分別為561、693和714bp，長度與理論值相符。2.重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI、BamHI雙酶切，電泳顯示在相應位置出現(xiàn)條帶，與預期大?。?/p>

6、561、693和714bp）一致。對酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進行送樣測序，測序結果經(jīng)比對后與原始序列同源性100％，表明成功構建了重組質(zhì)粒。3.采取各組份樣品，進行 SDS-PAGE分析，電泳顯示在相應位置（47KD、52KD、53KD）出現(xiàn)明顯條帶，表明融合蛋白SAG2、GRA6和GRA7成功得到了表達，表達主要方式為包涵體表達。4.融合蛋白經(jīng)過免疫印跡分析，在相應位置（47KD、52KD、53KD）出現(xiàn)明顯條帶，表明融合蛋白SAG2、