家蠶胞內維甲酸結合蛋白的表達和功能分析.pdf

1、胞內維甲酸結合蛋白(cellular retinoic acid binding protein，CRABP)是胞內脂結合蛋白的一種，與維甲酸(retinoic acid，RA)的生物學功能密切相關。維甲酸是一種重要的信號分子，能通過調節(jié)多種基因的轉錄、表達，誘導細胞的增殖、分化、凋亡。在脊椎動物中存在兩類CRABPs，它們能促進維甲酸的降解或轉運維甲酸到細胞核，調節(jié)基因的轉錄。 我們從本實驗室構建的家蠶蛹cDNA文庫中獲得一

2、條cDNA序列，序列比對后推測可能是家蠶維甲酸結合蛋白基因，并首次研究了該蛋白的功能。通過RT-PCR的方法獲得了該基因的ORF并與NCBI的Genbank數據庫進行比對，該ORF序列與家蠶CRABP mRNA的同源性為100﹪，與其它幾種無脊椎動物中CRABP的mRNA同源性為85﹪，因此我們認為此cDNA為BmCRABP (Rombyxmorti cellular retinoic acid binding protein)基因，G

3、enBank登錄號為EF112401。該基因編碼132個氨基酸，其氨基酸序列與無脊椎動物中該蛋白的氨基酸序列同源性較高(達90﹪)。根據序列比對的結果和1CRABP-Ⅰ，CRABP-Ⅱ的氨基酸序列中對配體結合起重要作用的氨基酸推測BmCRABP的關鍵氨基酸可能是：D73、K79、D99。BmCRABP關鍵氨基酸的性質與CRABP-Ⅰ的比較相近，因此，推測BmCRABP的功能可能也與脊椎動物CRABP-Ⅰ的相類似，即BmCRABP與RA的

4、降解有關。 為了研究BmCRABP的功能，將該基因的ORF克隆到載體pET-28a(+)中，重組成功原核表達質粒pET-28a(+)-CRABP，并轉化感受態(tài)細胞E．coli BL21(DE3)，經IPTG誘導表達后SDS-PAGE檢測，與陰性對照相比在18kDa處有一特異性條帶，與預期值相符。重組蛋白以可溶的形式表達，通過分子篩和親和層析純化了重組蛋白，并使用該重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，效價大于1∶12800。

5、 生物信息學分析推測BmCRABP可能與RA的降解有關，因此我們研究了BmCRABP和全反式維甲酸(a11-trans retinoic acid，atRA)的關系。首先，我們重組了真核表達質粒pEGFP-Cl-CRABP，并用BmCRABP的ORF制備了RNAi用的dsRNA，用脂質體分別轉染家蠶卵巢細胞Bm5后，細胞會過量表達CRABP或抑制CRABP的表達。我們用不同量的dsRNA轉染細胞，atRA處理后用MTT試驗檢測

6、細胞的活力，以此確定了最佳轉染條件。這個試驗不僅證明干擾BmCRABP的表達使細胞對RA引起的生長抑制更加敏感，同時也證明了轉染的有效性。隨后用pEGFP-Cl-CRABP和dsRNA分別轉染細胞，MTT試驗表明，當Bm5細胞過量表達CRABP時，用atRA處理后，細胞對atRA誘導的生長抑制產生耐受性；當CRABP的表達被干擾而降低時，細胞對atRA引起的生長抑制作用更加敏感。亞細胞定位分析發(fā)現，CRABP是一種細胞質蛋白，用atRA