一種嵌合型不依賴于CAR的膀胱癌特異性溶瘤腺病毒構建及其抗膀胱癌作用研究.pdf

1、目的：膀胱癌是泌尿系統(tǒng)疾病中最常見的惡性腫瘤之一，且隨著空氣污染的加重和吸煙人數(shù)的增加膀胱癌的發(fā)病率逐年增高。膀胱癌的治療多采用手術、放療、化療和灌注療法，但這些方法尚存在遠期治愈率低、復發(fā)率高的缺點。近些年膀胱癌的基因治療成為了一個新興的治療手段，其中通過構建攜帶目的基因的溶瘤腺病毒靶向殺傷膀胱癌細胞是一個新的研究方向。大部分關于膀胱癌溶瘤腺病毒生物治療的研究中，應用的載體多為5型腺病毒，該病毒主要通過識別膀胱癌細胞表面的柯薩奇-腺病

2、毒受體（coxsackie adenovirus receptor,CAR）進入腫瘤細胞發(fā)揮溶瘤作用。但是對于一些分化程度低的腫瘤細胞，其表面CAR的表達量低，從而阻礙了5型腺病毒發(fā)揮抗膀胱癌作用。因此，本課題致力于構建一種不依賴于CAR的嵌合型膀胱癌特異性溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A，該病毒可以通過膀胱癌廣譜表達的CD46分子進入腫瘤細胞發(fā)揮溶瘤作用。順鉑是膀胱癌的治療中較為常用的一種化療藥物，我們通過一系

3、列體外實驗研究Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A聯(lián)合順鉑是否具有協(xié)同抗腫瘤作用。不依賴于CAR的嵌合型溶瘤腺病毒的構建及其與順鉑的聯(lián)合應用為膀胱癌的基因治療提供了一個新的思路，拓展了膀胱癌治療領域。
　　方法：將嵌合5型腺病毒纖毛尾區(qū)和11型腺病毒纖毛軸區(qū)及旋鈕區(qū)的骨架質粒 Ad5/F11p，與我們實驗室前期構建的穿梭質粒Rp-PSCAE-UPII-E1A在大腸桿菌 BJ5183中進行同源重組形成重組質粒pAd5/F1

4、1p-PSCAE-UPII-E1A，并通過限制性內切酶和聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR)這兩種方法對重組質粒進行鑒定。根據(jù) pAdEasy-1系統(tǒng)，重組質粒pAd5/F11p-PSCAE-UPII-E1A在HEK293細胞內包裝出不依賴于CAR的嵌合型膀胱組織特異性溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A，通過PCR的方法對其進行鑒定，對鑒定正確的病毒進行純化、擴增和滴度測定。

5、將新構建的溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A作用于5637、EJ和 T24三種膀胱癌細胞，通過CCK-8、實時熒光定量PCR（qRT-PCR）、Western blot、RNA干擾技術及流失細胞術等方法測定Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A對不同CAR表達情況的膀胱癌細胞的抗腫瘤作用，以及探討Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A對膀胱癌細胞周期的影響。最后通過體外實驗研究Ad5/F11p-PS

6、CAE-UPII-E1A聯(lián)合順鉑對5637、EJ和T24三種膀胱癌細胞的抗腫瘤作用，并通過對相關凋亡基因Fas、Bax、Bcl-2及cleaved Caspase3的檢測初步探討Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A聯(lián)合順鉑抗膀胱癌的作用機制。
　　結果：（1）我們將嵌合5型腺病毒纖毛尾區(qū)和11型腺病毒纖毛軸區(qū)及旋鈕區(qū)的骨架質粒 Ad5/F11p，和穿梭質粒Rp-PSCAE-UPII-E1A進行同源重組，經(jīng)鑒定形成了正確的

7、重組質粒pAd5/F11p-PSCAE-UPII-E1A，并根據(jù)pAdEasy-1包裝系統(tǒng)，包裝出了不依賴于CAR的嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A，通過純化、擴增及病毒滴度測定，我們得到的病毒滴度為1×1010PFU/ml。（2）實時熒光定量PCR結果顯示在5637、EJ及T24細胞中，T24細胞CAR的表達量低，而5637、EJ及 T24這三種細胞均高表達 CD46分子。（3） Ad5/F11p-PSC

8、AE-UPII-E1A可以進入CAR高表達5637、EJ細胞和CAR低表達的T24進行復制，并發(fā)揮抗腫瘤作用，且殺傷作用均優(yōu)于Ad5-PSCAE-UPII-E1A，而對人正常尿路上皮細胞株 SV-HUC-1均無殺傷作用。（4）嵌合型病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A進入膀胱癌細胞進行復制發(fā)揮抗腫瘤作用和細胞表面CAR的表達量無關：該病毒分別感染未經(jīng)CAR-SiRNA處理的膀胱癌細胞（EJ、5637、T24）和 CAR-S

9、iRNA干擾的膀胱癌細胞（ EJ-CAR-SiRNA、5637-CAR-SiRNA、T24-CAR-SiRNA）后，E1A蛋白的表達和體外抗增殖作用在在EJ和EJ-CAR-SiRNA、5637和5637-CAR-SiRNA、T24和T24-CAR-SiRNA之間無差異。（5）Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A感染5637、EJ及T24這三種膀胱癌細胞后可以阻滯大部分膀胱癌細胞周期于 G1期。（6） Ad5/F11p-PSCA

10、E-UPII-E1A聯(lián)合順鉑作用于5637、EJ及T24這三種膀胱癌細胞后具有協(xié)同抗膀胱癌作用。（7）Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A聯(lián)合順鉑可以誘導膀胱癌細胞發(fā)生早期凋亡，且發(fā)生早期凋亡的細胞數(shù)目多于順鉑單用組和Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A單用組。（8）Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A聯(lián)合順鉑作用于5637、EJ及T24這三種膀胱癌細胞后可以上調Fas、Bax和cleaved Caspas

11、e3基因的表達，下調Bcl-2基因的表達。
　　結論：我們構建出了一種不依賴于CAR的嵌合型膀胱癌特異性溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A，經(jīng)純化、鑒定和滴度測定，該病毒純度好滴度高可用于后續(xù)研究；這種嵌合型病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A可進入5637、EJ及T24這三種膀胱癌細胞發(fā)揮抗腫瘤作用，且效果優(yōu)于 Ad5-PSCAE-UPII-E1A；Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1