煙草中與RNA干擾抑制子HC-pro互作蛋白的鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、中國農業(yè)大學博士學位論文煙草中與RNA干擾抑制子HCpro互作蛋白的鑒定姓名：靳永勝申請學位級別：博士專業(yè)：遺傳學指導教師：王濤20051001AbstractPot／viraihelpercomponentproteinaseflCpro)ofPVYisapotentRNAjsuppressorToinv髂tigatethemolecularmechanisminwhichtheHCpresuppressesRN燦weusedtheH

2、CproasbaittoScreenforinteractingproteins婦atobaccoeDNAlfbraryinayeasttwohybridsDtem1飛ebaitplasmidwasconstructedwiththefulllengthPwHCprofusedwiththepGBKT7DNAbindingdomain(pGBKTTHCproTip)andthenwastransferredintotheyeastSUa

3、jnsY18711”tobaccoleafc【INAhbraryfusedtotheGAL4activationdomain(pGADT7RecLeu)wasintheyeaststrainAHl09LetthelibraryhoststramAHl09matingwiththebaitstrainY187thematingmixtureWasspreaddirectlyOOtheSD／Ad啦Iis／Len／Trpselectionnl

4、lxlimIntheSCreen，therewem136positiveclonesfurthea)(Gsiadosidsseactivity120eDNAplasmidsfromthe136clonesWeresequencedTwentyoneproteinsWereencondedbythe120cDNAplasmidsThe21purifiedcDNAplasmidswereretrensformedintotheyeastst

5、rainAHl09togetherwiththebaitplasmidpBGKIVHCpretotesttheaXGalactosidaseactivityandinteractionspecificityTwentyeDNAplasmidsdisplayedspecmcandsignificantinteraction謝thPVYHI唧oTWoofthe20cDNAplasmidshowstrongerinteractionandwe

6、redesignatedSZIandSZ2respectivelyThefulllengthd)NAofSZlandSZ2wereclonedwith5’RACEandRTPCRSZlencedsamuIllzincfingerproteinwith8CCHCzingfingermotifs，aRSmotifatNendandaRGGboxbetweentheseventhandeighthfingerAisomerofSZlWasfo

7、undwithsixaminoacidslost(1621)andtwoaminoacidschanged(7：StoG；35：Dtotl)neartheNendAbetasubonitof20SproteasumeWasencodedbySZ2SZIandSZ2wereclonedOnthepFSCIeuvectorwithHeprorespectivelyforcoimmunoprecipitationinyeastcells1卿c

8、ouldbcpulleddownbySZlands恐respectivelyTheresultsshowedthatSZIandSZ2canintenctwithHCpmrespectivelyToobtainproteinsofSZland522SZlwasclonedonthepMALc2xvectorandSZ2WasclonedonthepET30avectorTherecombinantplasmidswe∞transform

9、edintoEcoliexpressions舡ainTBlandB121respectively11mfusionpreteinsofSZlwithMBPandSZ2with6xHisCanbeexpressedafterieducedwithIPTGThenativefusionpreteinsofSZlandSZ2havebeenpurifiedTherelationbetweentheSZI／SZ2andRNAiisuoderst

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