擬南芥內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Profilin2蛋白結合蛋白的分離與純化.pdf

1、本文研究根據(jù)前期研究達到的結果，試圖從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上分離和鑒定與Profilin 2特異結合的蛋白質(zhì)，為說明Profilin 2在細胞中的特異分布提供科學依據(jù)。 為了從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離蛋白，選用擬南芥懸浮細胞為實驗材料。利用密度梯度離心方法分離出純化的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，經(jīng)過對傳統(tǒng)實驗方法的改進，將原來200分鐘的離心時間縮短到了70分鐘，從而保證了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的膜蛋白具有更好的生物活性，并且通過改變蔗糖密度梯度離心時各層蔗糖溶液的體積比例，使粗面內(nèi)

2、質(zhì)網(wǎng)的產(chǎn)率有了明顯的增加。通過電鏡觀察，證明獲得了較高純度的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。利用純化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜與原核表達、純化的Profilin 2包被的膠體金顆粒的結合實驗，證明了Pofilin2是與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上膜蛋白的相互作用而結合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的。為了分離與Pofilin2特異結合的膜蛋白，利用原核表達、純化的Profilin 1和Profilin2結合在Ni-NTA的瓊脂糖上，再結合Pull-down技術，將分離出的蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE電泳，用改

3、進的銀染方法進行電泳結果顯色，顯示出有4條比較明顯地與Profilin 2特異結合的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜蛋白。選擇了其中一條含量最高的特異結合Profilin 2的蛋白條帶(28 kDa未知蛋白)進行切膠回收，使用LC-MS/MS液相層析串聯(lián)式質(zhì)譜儀進行蛋白質(zhì)的特性分析。根據(jù)質(zhì)譜儀檢測到的所有肽段與擬南芥中已知蛋白質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行匹對，結果顯示，質(zhì)譜儀檢測到的分值最高的肽段：擬南芥Profilin 1的N末端第56個氨基酸到第75個氨基酸中的