Dok6在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起生長過程中的功能研究.pdf

1、Trk((t-)ropomyosin-(r-)elated(k-)inase，原肌球蛋白相關(guān)激酶)是細胞膜表面的一類重要酪氨酸激酶，其在神經(jīng)細胞的存活、增殖、分化、遷移、凋亡以及學習和記憶等高級功能中都扮演著關(guān)鍵角色。Trk受體屬于受體酪氨酸激酶超家族，一共有三個家族成員：TrkA、TrkB和TrkC。他們的高親和力配體是神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophins）家族，該家族成員包括NGF、BDNF、NT-3、NT-4等等。通過與神經(jīng)營

2、養(yǎng)因子相結(jié)合，Trk受體迅速二聚化并激活其自身酪氨酸激酶活性，進而可以募集多種胞漿信號蛋白并將其磷酸化，從而將胞外信號傳遞至胞內(nèi)。
　　 Dok((d-)ownstream(o-)ftyrosine(k-)inase/Dockingprotein)是一類重要的胞漿接頭蛋白，參與了多個信號通路的轉(zhuǎn)導。該家族由七個成員組成：Dokl至Dok7。Dok家族蛋白符合胞漿信號蛋白的典型結(jié)構(gòu)特征：N端PH結(jié)構(gòu)域、中央PTB結(jié)構(gòu)域以及C末端區(qū)

3、域，因此可以作為多種非受體酪氨酸激酶（如Src家族激酶）及受體酪氨酸激酶（如胰島素受體、c-Ret受體、Trk受體等）的底物被募集及磷酸化，從而調(diào)節(jié)下游信號。
　　 本室前期工作表明Dok5可以與TrkB和TrkC受體相互作用并作為二者的底物激活MAPK信號通路。由于Dok5與Dok6均在神經(jīng)系統(tǒng)特異性高表達，并且同源性分析結(jié)果顯示二者在同家族的七個成員中同源性最高，因此我們預測Dok6可能也參與神經(jīng)系統(tǒng)中Trk受體家族的信號轉(zhuǎn)

4、導過程。接下來，首先利用酵母雙雜交系統(tǒng)進行了驗證。結(jié)果證明在酵母雙雜交系統(tǒng)中，Dok6與TrkC受體的胞內(nèi)區(qū)有明顯相互作用，而與TrkA和TrkB的相互作用很弱。通過結(jié)構(gòu)域分段克隆，進一步證明了Dok6是通過其PTB結(jié)構(gòu)域與TrkC受體發(fā)生相互作用的。以上試驗結(jié)果在GST-pulldown和CoIP實驗中得到了進一步的證實。隨后利用氨基酸突變分析的方法明確了Dok6通過其PTB結(jié)構(gòu)域結(jié)合于TrkC受體胞內(nèi)區(qū)的NPQY模體，并且這種相互作

5、用依賴于受體的激酶活性。
　　 為了在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)驗證上述相互作用，我們利用原位雜交及免疫熒光實驗證實TrkC受體與Dok6在來源于小鼠大腦皮層的原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中共定位，并且免疫沉淀實驗進一步在體內(nèi)證實了二者的相互作用，提示Dok6在神經(jīng)系統(tǒng)中作為TrkC受體的底物行使重要功能。通過RNA干擾技術(shù)，在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元中敲低Dok6的表達并證明其在神經(jīng)突起的生長過程中發(fā)揮重要作用，隨后通過外源性NT-3的刺激證實Dok

6、6作為TrkC受體的底物通過NT-3/TrkC通路在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元的神經(jīng)突起生長過程中發(fā)揮作用。最后，利用免疫沉淀及質(zhì)譜鑒定的方法鑒定出可能與Dok6發(fā)生相互作用的26個蛋白，通過對其進行生物信息學分析最終鎖定9個參與了神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的靶蛋白。
　　 綜上所述，我們證實了Dok6依賴其PTB結(jié)構(gòu)域結(jié)合于活化的TrkC受體的NPQY模體，并且作為TrkC受體的底物通過NT-3/TrkC通路在原代培養(yǎng)的小