超聲輻照陽離子微泡介導內皮抑素基因治療視網膜新生血管的實驗研究.pdf

1、第一部分.普通脂質及陽離子微泡制備及性能檢測
　　目的:構建普通脂質微泡（NMB）、陽離子微泡（CMB），并檢測其基本物理特征；比較NMB和CMB攜載內皮抑素質粒（pEZ-M46-ES）的能力。
　　方法:采用機械震蕩法構建兩種不同的脂質微泡，通過在成膜材料中加入DC-膽固醇（DC-cholesterol）使微泡表面帶正電荷從而構建陽離子微泡（CMB），光鏡下觀察不同微泡基本形態(tài)，并檢測其濃度、粒徑、表面電位及載基因能力等基

2、本特性。
　　結果:NMB、CMB均成功構建，光鏡下大小均一，分散度較好；其表面電荷、粒徑及濃度分別為+25.62±4.38mV，1.64±0.28μm，4.16±0.18×109/ml。固定微泡的濃度為5×108/ml，兩者的載基因量分別為2.01±0.74μg和19.02±0.76μg。
　　結論:NMB及CMB制備成功。
　　第二部分.超聲輻照陽離子微泡介導內皮抑素基因轉染人視網膜血管內皮細胞
　　目的:研

3、究NMB、CMB攜內皮抑素質粒在超聲作用下轉染HRECs細胞轉染效率，以及對細胞周期、體外血管成型及細胞遷移的影響。并與脂質體載體進行對比。
　　方法:實驗分組：①空白對照組（C）②質粒+普通離子微泡+超聲輻照組(NMB)③質粒+脂質體組（L）④質粒+陽離子微泡+超聲輻照組(CMB)。①組以空白對照組，②組以超聲輻照普通微泡介導內皮抑素基因轉染作為陽性對照，③組以脂質體2000介導基因轉染作為陽性對照，④組以超聲輻照陽離子微泡介導

4、內皮抑素基因進行轉染。超聲（1MHz,1W/cm2, and50％duty cycle(DC),30seconds）作用下轉染HRECs，轉染后收集細胞行流式細胞檢測轉染效率及細胞周期，qPCR及Western-blot分別檢測endostatin, VEGF、bcl-2和bcl-xl mRNA及蛋白表達情況，通過體外血管成型及細胞遷移評價內皮抑素質粒在不同載體介導轉染后的治療效果。
　　結果:各組轉染pEZ-M46-ES質粒后2

5、4h基因轉染率分別為:1.20±0.21%，28.25±0.57%，30.74±7.50%和41.84±8.90%；轉染后24h及48h流式細胞術檢測細胞周期顯示CMB組處于G1期的細胞較其他各組明顯增多；MTT檢測結果顯示CMB組對HRECs的生長曲線較其他各組有明顯抑制作用；qPCR及Western blot檢測顯示CMB組endostatin mRNA及蛋白表達較其他各組明顯增加，而VEGF、bcl-2和bcl-xl的mRNA及蛋

6、白表達較其他各組明顯減少；各組HRECs形成網狀新生血管的數(shù)量分別為26.47±3.52，15.17±1.52，13.19±3.43，8.42±1.02個；各組HREC細胞遷移數(shù)量分別為：30±1.57，22.4±2.07，21.6±2.17，15.4±2.7個。
　　結論:與普通脂質微泡和脂質體作為基因載體相比，CMB組基因轉染效率明顯提高；普通脂質微泡與脂質體也可增加基因轉染效率，但兩者基因轉染效率無明顯差別。超聲輻照微泡介導

7、內皮抑素基因轉染HRECs，可明顯抑制體外血管成型及細胞生長、增殖及遷移。
　　第三部分.內皮抑素基因對小鼠視網膜新生血管的抑制作用
　　目的:分別以脂質體、普通微泡和陽離子微泡作為基因載體，后兩者聯(lián)合超聲輻照，介導內皮抑素基因轉染小鼠視網膜，比較其抑制新生血管的效果并探討其可能機制。
　　方法:分別將普通微泡，脂質體及陽離子微泡與pEZ-M46-ES質粒進行孵育，得到載基因的脂質體或微泡。采用高濃度氧誘導C57BL/

8、6J小鼠建立OIR(Oxygen-inducedretinopathy,氧誘導視網膜病變)動物模型。將60只視網膜新生血管模型小鼠,隨機分為以下3組：①質粒+普通離子微泡+超聲輻照組(NMB)②質粒+脂質體組（L）③質粒+陽離子微泡+超聲輻照組(CMB)。①組以超聲輻照普通微泡介導內皮抑素基因轉染，②組以脂質體2000介導基因轉染，③組以超聲輻照陽離子微泡介導內皮抑素基因轉染。小鼠視網膜新生血管模型建造后用微量注射器按以上分組右眼玻璃體

9、腔注射基因及載體復合物2μl，①、③組在注射后立即使用超聲輻照眼球。左眼作為對照組（C）。于注射后5天行視網膜組織切片HE染色計數(shù)突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核數(shù)目；注射后5、14、28d激光共聚焦顯微鏡下觀察各組pEZ-M46-ES的熒光表達強度，qPCR法檢測各組視網膜組織中endostatin、VEGF、bcl-2和bcl-xl mRNA的表達情況，Western blot法檢測各組視網膜組織中endostatin、VEGF、b

10、cl-2和bcl-xl的蛋白表達情況。
　　結果:視網膜組織切片HE染色結果示CMB組小鼠突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核數(shù)較其他各組顯著減少，各組細胞核個數(shù)分別為：41.7±6.1，26.1±1.4，23.1±3.5，16.4±1.2個。激光共聚焦顯微鏡下觀察并計算視網膜色素上皮層熒光強度所有數(shù)值的平均值，統(tǒng)計結果顯示，轉染后5及14d，NMB組、L組及CMB組的pEZ-M46-ES熒光表達強度均逐漸增強，轉染后28d各組 pE

11、Z-M46-ES熒光表達強度較第14d減弱，CMB組與NMB組及L組相比有統(tǒng)計學差異；NMB組與L組在轉染后5d及14d兩組之間的熒光表達強度無明顯統(tǒng)計學差異，但在轉染后28d，NMB組的pEZ-M46-ES熒光表達強度較L組強，其差異具有統(tǒng)計學意義。視網膜組織qPCR及Western blot檢測顯示CMB組endostatin的 mRNA及蛋白表達較其他各組明顯增加，而VEGF、bcl-2和bcl-xl的mRNA及蛋白表達較其他各組