小膠質(zhì)細(xì)胞Rho-ROCK通路調(diào)控對(duì)脊髓損傷修復(fù)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬功能在脊髓損傷修復(fù)中起重要作用，既往研究顯示Rho/ROCK通路參與脊髓損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，神經(jīng)元凋亡及軸突再生過(guò)程。本試驗(yàn)旨在進(jìn)一步研究Rho/ROCK通路對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移及吞噬功能的影響，并進(jìn)一步探討ROCK抑制劑對(duì)大鼠脊髓損傷后早期修復(fù)的影響及其機(jī)制。
　　方法：分別采用BV2細(xì)胞和大鼠脊髓原代小膠質(zhì)細(xì)胞用于體外實(shí)驗(yàn)、自由落體打擊法建立大鼠脊髓損傷模型；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BV2細(xì)胞和原代小膠質(zhì)細(xì)胞

2、的吞噬功能；Transwell小室檢測(cè)原代小膠質(zhì)細(xì)胞遷移功能；免疫熒光法觀察細(xì)胞形態(tài)變化以及ROCK2、MBP的表達(dá)；ROCK活性試劑盒檢測(cè)ROCK激酶活性；Western Blot檢測(cè)ROCK2、MAPKs、IL-1β和TNFα的表達(dá)；透射電子顯微鏡檢測(cè)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化、遷移及吞噬功能；凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡；BBB評(píng)分評(píng)估運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。
　　結(jié)果：
　　1）BV2細(xì)胞表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記Iba1及ROCK2(10

3、0％)。Y27632和fasudil干預(yù)0.5,1,3h后，與對(duì)照組相比，ROCK激酶活性明顯降低（n=4,*p<0.01），各組LDH分泌無(wú)明顯差別（n=4, p>0.05）。
　　2）Y27632和fasudil干預(yù)后1h后，與對(duì)照組相比，F(xiàn)ITC-dextran（40000MW）吞噬率及平均熒光強(qiáng)度明顯增高（n=5,*p<0.01）。
　　3）Y27632和fasudil干預(yù)引起B(yǎng)V2細(xì)胞ERK磷酸化增加、JNK和p3

4、8磷酸化無(wú)明顯改變，此作用可以在干預(yù)0.5h出現(xiàn)，并一定程度持續(xù)存在（n=5,*p<0.01）。
　　4）U0126可抑制Y27632和fasudil引起的ERK磷酸化增加，并可抑制Y27632和fasudil引起的BV2細(xì)胞吞噬能力的增加（n=5,*p<0.01,＃p<0.05）。
　　5）Y27632和fasudil可引起B(yǎng)V2細(xì)胞形態(tài)變大，形態(tài)不規(guī)則以及多的細(xì)小的枝杈，U0126可逆轉(zhuǎn)上述形態(tài)改變。
　　6）小膠

5、質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記Iba1顯示原代培養(yǎng)的大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞純度為98%以上，且均表達(dá)ROCK2(100%)。Y27632和fasudil干預(yù)后1h，與對(duì)照組相比，F(xiàn)ITC-dextran微粒吞噬率及平均熒光強(qiáng)度明顯增高（n=4,*p<0.01）。
　　7）Y27632和fasudil干預(yù)后6h，與對(duì)照組相比，小膠質(zhì)細(xì)胞遷移率明顯增高（n=4,*p<0.01,＃p<0.05）。
　　8）Y27632和fasudil干預(yù)引起原代小

6、膠質(zhì)細(xì)胞ERK磷酸化增加，此作用可以在干預(yù)1h出現(xiàn)，并一定程度持續(xù)存在（n=4,*p<0.01,＃p<0.05）。
　　9）U0126可抑制Y27632和fasudil引起的ERK磷酸化增加，并可抑制Y27632和fasudil引起的小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬改變（n=4,*p<0.01,＃p<0.05）。
　　10）U0126可抑制Y27632和fasudil引起的ERK磷酸化增加，并可抑制Y27632和fasudil引起的小膠質(zhì)細(xì)胞

7、遷移功能改變（n=4,*p<0.01,＃p<0.05）。
　　11）Y27632和fasudil干預(yù)1h后，與對(duì)照組相比，小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)即有明顯改變，表現(xiàn)為形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則，并伸出多個(gè)長(zhǎng)的枝杈。U0126可抑制Y27632和fasudil引起的小膠質(zhì)形態(tài)改變。
　　12）在脊髓損傷后1,3和7d時(shí)，ROCK活性明顯增高，ROCK抑制劑fasudil可顯著抑制損傷脊髓ROCK活性（n=4,*P<0.01）。
　　13）透射

8、電鏡顯示ROCK抑制劑fasudil可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能，干預(yù)后灶周小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目變多、形態(tài)變大，吞噬髓磷脂碎片增多，活化小膠質(zhì)細(xì)胞周邊殘存磷脂碎片及紅細(xì)胞減少。
　　14）TUNEL顯示 ROCK抑制劑 fasudil干預(yù)后1d時(shí)，組織細(xì)胞凋亡顯著減少（n=4,*P<0.01）。
　　15）MBP染色顯示脊髓損傷14d時(shí)，fasudil干預(yù)顯著減少脊髓損傷髓鞘缺損面積；BBB評(píng)分顯示，fasudil可以促進(jìn)脊髓損傷運(yùn)動(dòng)