年齡相關性白內障晶體上皮細胞Klotho基因的表達及甲基化水平初步研究.pdf

1、目的:
　　觀察正常人晶體與年齡相關性白內障(age-related cataract，ARC)晶體上皮細胞(lens epithelial cell，LECs)中Klotho基因mRNA、蛋白表達情況及甲基水平，分析Klotho基因與ARC之間的關系，探討該基因的表觀遺傳變化在ARC發(fā)生中的調控機制。
　　材料與方法:
　　1.標本收集:收集2013年9月至2014月10月在河南省人民醫(yī)院眼科行年齡相關性白內障手術的

2、住院患者60例（患眼60只），均選擇第3期成熟期皮質性白內障。術前排除糖尿病、高血壓、心臟病等全身疾患，并排除虹膜睫狀體炎、青光眼、限外傷，以及長期眼放射線接觸等眼病史，男女不限。實驗分組為成青年透明晶體（A組18-30歲，平均年齡，mean±SD，25.00±3.97歲）30例(30眼)，男13例，女17例;中年ARC組（B組40-49歲，平均年齡，mean±SD，45.33±3.15歲）30例（30眼）男11例，女19例;老年ARC

3、組（C組67-85歲，平均年齡，mean±SD，75.53±5.76歲）30例（30眼），男12例，女18例。術前由同一醫(yī)生檢查和記錄患者性別、年齡、晶狀體混濁程度和類型。白內障超聲乳化手術由同一醫(yī)生進行，術中常規(guī)連續(xù)環(huán)形撕囊，直徑約5.5mm。正常人晶體(normaltransparent group)前囊膜來源于河南省立眼科研究所眼庫角膜移植術后透明晶體眼球，顯微鏡下同樣方法留取正常青年人晶狀體前囊膜作為對照組。所有晶體前囊膜置于P

4、BS緩沖液中沖洗，排除血液、虹膜色素、晶體皮質、玻璃體等眼內組織的附著。以上取材均通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準同意。將獲得樣品立即置與-80℃冰箱保存。進行基因、蛋白及甲基化檢測。
　　2.Klotho基因RT-PCR檢測mRNA:將收集的晶體前囊膜迅速加入Trizol的Eppendofff管，PBS沖洗，離心沉淀5×105個細胞，去上清，加入細胞裂解液，離心5min，吸盡液體，干燥RNA，1min，加入焦碳酸二乙酯(diethyp

5、yrocarbonate，DEPC)水溶解，-80℃冷凍保存。反轉錄合成cDNA:測得比值在0.6～1.19之間。普通瓊脂糖凝膠電泳進行RNA質量鑒定:(1)制備瓊脂糖凝膠:稱取瓊脂糖，加入1x電泳緩沖液，待水合數(shù)分鐘后，置微波爐中將瓊脂糖融化均勻，加熱時應蓋上封口膜。(2)膠板的制備:將膠槽置于制膠板上，插上樣品梳子，觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙，待膠溶液冷卻至50℃左右時，輕輕倒入電泳制膠板上，除掉氣泡;待凝膠冷卻

6、凝固后，垂直輕拔梳子;將凝膠放入電泳槽內，加入1x電泳緩沖液，使電泳緩沖液面剛高出瓊脂糖凝膠面。(3)加樣:在薄膜上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)為2X。用10μL微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內。4.電泳:加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，最高電壓不超過5V/cm。當溴酚藍移動到距離膠板下沿約1cm處時，停止電泳。(5)觀察和拍照:電泳完畢，取出凝膠。電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分鐘，于

7、凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存之。引物設計:利用網(wǎng)絡資源GenBank(Klotho ID:16591; Klotho mRNA:NM-013823.1)獲得人Klotho基因序列，使用軟件Primer Prem ier5.0設計特異性引物，正義:5'-ACCTGGTGGCGCACAC，反義:5'-TTGGCAAACCAACCTAGTACA;GAPDH正義:5'-GAAGGTGAAGGTCG GAGT,反義5'-GAAGATGGTGATGGG

8、ATTTC。反轉錄反應條件:20℃10min，42℃60min使RNA反轉錄為cDNA，70℃10min滅火反轉錄酶，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。RT-PCR的檢測:常規(guī)PCR產物經(jīng)適當濃度瓊脂糖凝膠電泳成像分析，目的條帶清晰，且沒有雜帶，說明引物設計合成無誤，可以進行熒光定量PCR。實時熒光定量PCR的檢測:由美國ABI公司合成TaqMan探針，熒光定量PCR儀上進行擴增。Klotho-PCR基因的反應體系:10×PCR緩沖液(Mg2+

9、free)3.0μl;MgCl2(25mmol/L)1.8μl; dNTP(25mmol/L)0.36μl;上游引物（10μmol/L）1.0μl;下游引物(10μmol/L)1.0μl; Taq酶(5U/μl)。進行溶解曲線分析及瓊脂糖凝聚電泳驗證擴增。每個樣本均檢測3次，取其平均值，用2-ΔΔCt法計算KlothomRNA在不同組別標本中的表達變化。
　　3.免疫組化染色（immunohistochemistry，IHC）:將

10、收集的晶體前囊膜標本PBS液沖洗后，細胞面朝上平鋪于載玻片上，空氣干燥，ABC法染色，室溫下1:200山羊抗人Klotho抗體過夜，二抗驢抗羊1∶50作用2小時，在DAB反應液中作用5min，PBS液沖洗、終止染色，干燥后封片。結果判定:隨機選取5個視野，計數(shù)50個細胞，計數(shù)陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞百分率。陽性細胞比例的評分方法為:0分（陽性細胞比例≤5％），1分（5％＜陽性細胞比例≤25％），2分(25％＜陽性細胞比例≤50％)，3分

11、（50％＜陽性細胞比例≤75％），4分（75％＜陽性細胞比例≤100％）。細胞的染色強度可分為0分（染色陰性），1分（淡黃色顆粒），2分（棕黃色顆粒），3分（褐色顆粒）;按照染色強度與陽性細胞比例綜合計分，根據(jù)上述2項結果乘積的分數(shù)分為4級，分數(shù)≤g記為-，4＜分數(shù)≤8記為+，8＜分數(shù)＜12記為++，分數(shù)=12記為+++。其中“-”記為Klotho表達陰性;“+”，“++”，“+++”記為Klotho表達陽性。
　　4.甲基化特異

12、性聚合酶鏈反應(methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)檢測Klotho甲基化水平分別提取3組標本的DNA，取500ng DNA進行亞硫酸鹽處理，按照EZ DNA Methylation-Gold Kit，取處理后的DNA1ul作為模板使用TaqGold DNA聚合酶進行甲基化特異性PCR擴增，反應體系12.5ul，反應條件:95℃變性10min，然后變性95℃30S，退火5

13、8℃30s，延伸72℃30S，共40個循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR產物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，在紫外檢測儀上觀察產物條帶。用MethPrimer軟件設計甲基化與未甲基引物:分別設計甲基化特異PCR引物(Klotho M primer)和非甲基化特異PCR引物(Klotho U primer)進行PCR反應。用甲基化特異引物進行PCR時，CpG島C堿基甲基化的DNA能產生特異PCR條帶，C堿基未甲基化的DN

14、A則不能產生PCR條帶。通過觀察klotho基因在人晶體上皮細胞中甲基化和非甲基化特異引物PCR擴增情況來判斷是否甲基化陽性。引物信息為Klotho(M)正義:5'-GTCGTCGTTGTAGTTCGTTATC，反義:5'-CAACAAACGCCGATAATAACG。Klotho(U)正義:5'-TTGTTGTTGTTGTACTTTGTTATT反義:5'-CCAACAAACACCAATAATAAC。(M):甲基化引物;(U):非甲基引物

15、。
　　4.統(tǒng)計學處理采用IBM SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)采用均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，當方差不齊時，采用Welch法進行組間比較;計數(shù)資料給出頻數(shù)及百分比，組間比較采用x2檢驗;等級資料給出百分比及平均秩次，組間比較采用Kruskal-Wallis法。
　　結果:
　　1.Klotho基因在晶體上皮的表達水平:Klotho基因在正常青年人晶體組、中年白內障組

16、及老年白內障組相對表達量分別是（mean±SD）:1.097±0.140，0.023±0.004，0.004±0.002，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　2.Klotho蛋白在晶體上皮細胞的表達水平:正常青年人晶體組Klotho蛋白呈陽性、均勻表達，表達部位位于胞漿及胞膜，中年白內障組表達呈弱陽性，位于晶體前囊膜邊緣位置，DAB顯色反應不均一，細胞形態(tài)變異，有偽足樣突起。老年白內障組表達呈陰性。3組比較差異有顯著性(P＜0

17、.05)。
　　3.Klotho基因甲基化表達水平:透明晶體組、中年白內障組及老年白內障組甲基化發(fā)生率分別是3.3％，56.7％，93.3％。白內障組甲基化發(fā)生率較透明晶體組明顯增高，差異有顯著性(P＜0.05)。Klotho基因甲基化與基因表達的關系:透明晶體組(A)低甲基化，老年年齡相關性白內障組(C)出現(xiàn)高甲基化，三組比較甲基化陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　年齡相關性白內障發(fā)病機制是個