瘦素上調(diào)mTORC1信號通路加速大鼠跟腱異位骨化.pdf

1、目的:探討瘦素在大鼠跟腱干細(xì)胞(TDSCs)成骨分化及跟腱異位骨化形成過程中的作用及機(jī)制，為異位骨化的預(yù)防和治療提供理論支持。
　　方法:體外實驗，提取大鼠TDSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，用不同濃度的瘦素(1、10、100ng/ml)或100ng/ml瘦素+10nM雷帕霉素處理，3天后通過CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖情況，14天后采用堿性磷酸酶(ALP)染色/活性實驗檢測ALP表達(dá)，茜紅素染色檢測礦化結(jié)節(jié)形成，熒光定量PCR檢測ALP、

2、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(OSX)及骨鈣素(OCN)，蛋白免疫印跡檢測Runx2、OSX以及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1)信號通路下游的磷酸化核糖體S6蛋白激酶(PS6K1)和磷酸化核糖體S6蛋白(PS6)的表達(dá)量。體內(nèi)實驗，選取6周齡雄性Sprague-Dawley大鼠建立跟腱中段切斷術(shù)模型，隨機(jī)分為對照組(control)、異位骨化組(HO)、異位骨化+雷帕霉素組(HO+RA)、異位骨化

3、+瘦素組(HO+LEP)、異位骨化+瘦素+雷帕霉素組(HO+LEP+RA)，采用瘦素及雷帕霉素處理10周，跟腱取材行伊紅-蘇木素染色檢測鈣化面積，micro-CT檢測異位骨化體積，免疫組織化學(xué)檢測瘦素、Runx2、OSX及PS6的表達(dá)量。
　　結(jié)果:體外實驗:瘦素在1-100ng/ml濃度范圍內(nèi)對TDSCs的增殖沒有顯著的毒性作用，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05);不同濃度的瘦素(1-100ng/ml)促進(jìn)TDSCs成骨分化過程中

4、ALP表達(dá)及礦化結(jié)節(jié)形成，并呈濃度依賴性增加，在100ng/ml瘦素時達(dá)到最大作用，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);不同濃度的瘦素(1-100ng/ml)促進(jìn)ALP、Runx2、OSX及OCN的mRNA表達(dá)，并隨著瘦素濃度的增加而增加，在100ng/ml瘦素時表達(dá)最強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);不同濃度的瘦素(1-100ng/ml)促進(jìn)Runx2、OSX、PS6K1及PS6蛋白的表達(dá)，并隨著瘦素濃度的增加而增加，在100n

5、g/ml瘦素時表達(dá)最強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);瘦素+雷帕霉素組較瘦素組的Runx2、OSX、PS6K1及PS6蛋白表達(dá)量均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。體內(nèi)試驗:HO組較control組的瘦素表達(dá)明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);HO+LEP組較HO組和HO+LEP+RA組的鈣化面積、異位骨化體積顯著增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);HO+RA組較HO組的鈣化面積和異位骨化體積顯著降低，

6、差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);HO+LEP組較HO組和HO+LEP+RA組的Runx2、OSX及PS6表達(dá)顯著增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);HO+RA組較HO組的Runx2、OSX及PS6表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論:瘦素上調(diào)mTORC1信號通路加速TDSCs成骨分化和跟腱異位骨化的形成，mTORC1信號通路抑制劑雷帕霉素可有效抑制瘦素誘導(dǎo)的TDSCs成骨分化和跟腱異位骨化形成，為