糖皮質激素在主動脈夾層血管重構中的調控機制研究.pdf

1、隨著社會老齡化的到來和人民生活水平的提高，血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病率逐年上升，而以主動脈夾層(aortic dissection,AD)為代表的主動脈擴張病是其中最兇險的一類。盡管AD的治療方式從巨創(chuàng)向微創(chuàng)發(fā)生了革命性變化，夾層的并發(fā)癥率和死亡率有了明顯降低，但仍有很多患者在明確診斷前或開始救治前即因夾層破裂而死亡。因此，闡明AD發(fā)病和轉歸的機制，對改善夾層預后至關重要。有證據(jù)表明血管炎癥反應在主動脈血管重構過程中起著重要作用，而糖皮質激素因

2、其強大的抗炎作用被廣泛用于臨床。最新的隨機對照臨床研究表明術前單次應用大劑量的糖皮質激素，在沒有增加不良事件發(fā)生率的基礎上能明顯降低腹主動脈瘤患者腔內隔絕術后全身炎癥反應綜合征的發(fā)生率，但糖皮質激素與AD的關系仍模糊不清。
　　目的:探討糖皮質激素在AD的發(fā)生、發(fā)展和轉歸中的作用，并進一步闡明糖皮質激素參與主動脈血管重構的細胞分子機制。
　　方法:1、臨床樣本研究:在符合倫理審查和患者知情同意情況下，收集AD、非破裂主動脈瘤

3、(non-ruptured aortic aneurysm，nAA)和健康對照者的血液標本，放射免疫法檢測血清皮質醇、血漿促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）的含量;同時收集行開放手術的AD、nAA患者和遺體捐獻者的主動脈，免疫組化法檢測主動脈中糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor, GCR)表達水平;收集夾層患者的臨床信息進行多元線性回歸分析，探討血清皮質醇含量

4、的影響因素。2、動物實驗研究:在獲得第二軍醫(yī)大學動物保護和使用協(xié)會的批準后，切除80只C57BL/6小鼠的雙側腎上腺，按2∶2∶1完全隨機分成三組，用血管緊張素Ⅱ建立AD模型，外加糖皮質激素或溶劑對照干預，三組分別為糖皮質激素干預組、模型組、溶劑對照組:記錄小鼠的死亡時間，Kaplan-Meier曲線計算小鼠累積生存率;血管緊張素Ⅱ干預前后每周尾動脈測壓，驗證血管緊張素Ⅱ是否起效;解剖獲取小鼠主動脈，借助Image-ProPlus軟件測

5、量小鼠主動脈外徑;蘇木素-伊紅染色，測量主動脈中膜厚度及觀察夾層發(fā)生率;Masson染色，檢測主動脈膠原容積分數(shù);免疫組化法檢測小鼠主動脈GCR表達及巨噬細胞的含量。3、細胞分子研究:體外培養(yǎng)入主動脈平滑肌細胞(humanaortic smooth muscle cell，HA-SMC)和巨噬細胞，酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測糖皮質激素對巨噬細胞分泌基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、基質金屬

6、蛋白酶-2抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）、腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)的影響;劃痕實驗檢測糖皮質激素對HA-SMC遷移的影響，細胞免疫熒光檢測糖皮質激素對HA-SMC表型轉換的影響;建立HA-SMC和巨噬細胞間接共培養(yǎng)體系，細胞流式實驗檢測細胞共培養(yǎng)及糖皮質激素對HA-SMC凋亡的影響，細胞免疫熒光檢測細胞共培養(yǎng)及糖皮

7、質激素對HA-SMC遷移的影響;高通量蛋白微陣列芯片檢測細胞間相互作用的關鍵因子，并用相應因子的中和抗體驗證其作用;應激和凋亡通路試劑盒檢測關鍵因子參與血管重構的信號分子通路，western blot驗證該信號分子的變化。
　　結果:1、臨床樣本研究:2012年10月至2013年12月，共收集在我血管外科中心治療經(jīng)可靠影像學方法診斷的82例AD，68例nAA及在我院體檢中心體檢的76例健康者的血液樣本，三組人群血清皮質醇含量分別為

8、173.98±23.44 ng/mL，136.60±21.83 ng/mL和129.00±27.56 ng/mL，AD組明顯高于nAA組(P＜0.001)和健康體檢組(P＜0.001);三組人群血漿ACTH含量分別為26.76±7.41 pg/mL，24.75±8.21pg/mL和25.64±7.38 pg/mL，三組間未見統(tǒng)計學差異;同期收集行開放手術的8例AD，8例nAA和8例遺體捐獻者的主動脈，三組GCR含量分別為14.25±1.

9、31％，13.39±1.42％和12.55±2.12％，未見明顯統(tǒng)計學差異;收集夾層患者的臨床信息行多元回歸分析發(fā)現(xiàn)夾層裂口數(shù)目是血清皮質醇含量的影響因素（偏回歸系數(shù)0.920，P=0.029）。2、動物實驗研究:最終納入糖皮質激素干預組、模型組和溶劑對照組分析的小鼠數(shù)量分別是31、27和13;模型組與糖皮質激素干預組(P=0.139)或溶劑對照組(P=0.107)的累積生存率無統(tǒng)計學差異（Log-rank檢驗）;模型組的小鼠收縮壓在血

10、管緊張素Ⅱ干預后明顯高于溶劑對照組，在血管緊張素Ⅱ干預后7天、14天、21天明顯低于糖皮質激素干預組;模型組的小鼠主動脈外徑明顯大于溶劑對照組（升主動脈:1458.49±257.96μmvs.1094.61±154.57μm，P＜0.001;主動脈弓:1449.48±290.34μmvs.986.38±151.16μm，P＜0.001;降主動脈:1343.47±238.48μmvs.980.36±98.48μm，P＜0.001)，模型組

11、小鼠的升主動脈外徑明顯大于糖皮質激素干預組（1458.49±257.96μmvs.1279.17±204.241m，P=0.005），主動脈弓和降主動脈外徑無明顯差異;模型組(29.6％)的小鼠AD發(fā)生率明顯高于糖皮質激素干預組(6.5％，P=0.034)和溶劑對照組(0％，P=0.037);模型組小鼠的主動脈中膜厚度明顯高于溶劑對照組（89.6±14.7μmvs.68.4±11.6μm，P＜0.001），但糖皮質激素干預組與模型組之間

12、無統(tǒng)計學差異（89.8±13.5μm vs.89.6±14.7μm，P=0.937）;模型組（24.2±6.0％）小鼠的主動脈膠原容積分數(shù)明顯低于溶劑對照組（31.7±6.3％，P=0.001）和糖皮質激素干預組(30.1±8.2％，P=0.003);模型組（9.3±3.0％）小鼠的主動脈GCR水平與糖皮質激素干預組(8.5±2.1％，P=0.235)或溶劑對照組（7.6±1.1％，P=0.115）無明顯不同;但模型組（9.3±3.5％

13、）小鼠的主動脈巨噬細胞含量明顯高于溶劑對照組（2.2±1.0％，P＜0.001）或糖皮質激素干預組（7.4±3.2％，P=0.041）。3、細胞分子研究:結果表明糖皮質激素能明顯抑制巨噬細胞分泌MMP-2，對TIMP-2的分泌無明顯影響;另外，高濃度糖皮質激素抑制巨噬細胞分泌TNF-α，低濃度糖皮質激素促進TNF-α的分泌;糖皮質激素減少HA-SMC的遷移，抑制HA-SMC向分泌型表型轉換;HA-SMC與巨噬細胞共培養(yǎng)抑制了HA-SMC

14、的凋亡，糖皮質激素加強這一效應，但對細胞遷移無影響;高通量蛋白微陣列鑒定出白介素-6（interleuin-6，IL-6）和可溶性腫瘤壞死因子Ⅱ型受體(solubletumor necrosis factor receptorⅡ，TNF-sRⅡ)可能是細胞間相互作用的關鍵因子，但抗體中和實驗證實了TNF-sRⅡ是關鍵因子，IL-6的作用未得到驗證。細胞共培養(yǎng)或糖皮質激素干預時，應激和凋亡通路試劑盒檢測到bad、HSP27、p38MAPK

15、和IkBa信號分子磷酸化水平的變化，western blot結果表明細胞共培養(yǎng)和糖皮質激素干預影響了p38MAPK和HSP27的磷酸化通路，參與血管重構。
　　結論:糖皮質激素正性調控主動脈血管重構，對AD的發(fā)生起著保護性作用。AD患者的血清皮質醇含量升高是機體為應對病理性血管重構作出的積極反應。糖皮質激素降低巨噬細胞分泌MMP-2減少主動脈膠原的降解，抑制巨噬細胞分泌TNF-α減輕管壁炎癥反應，抑制HA-SMC遷移維持管壁SMC