慢性HBV感染患者HLA-DR等位特異性CD4+T細胞表位研究.pdf

1、背景:
　　HBV病毒是導致肝損傷及肝炎最常見的病毒，其中有超過90％的嬰幼兒感染及3％-5％的成年人感染者最終發(fā)展成為慢性HBV感染。宿主的T細胞免疫應答對HBV感染結局起著非常重要的作用。而CD4+T細胞是宿主T細胞免疫應答的重要環(huán)節(jié)。隨著CD4+T研究的深入，發(fā)現(xiàn)其亞型較多，不同的不同的亞群功能不一樣，甚至對同一細胞亞群，不同研究的得出的結論也不一致，這可能與HBV病毒表位的不同及宿主HLA-Ⅱ類分子的多態(tài)性有關。為此，HB

2、V病毒特異CD4+T細胞的研究必須深入到HBV表位及HLA-Ⅱ類分子等位上，結合我們前期發(fā)現(xiàn)HLA-DR*0803偏向于免疫保護，而HLA-DR*1202偏向于免疫損傷，從功能上我們設想是不同的HLA-DR等位可能是通過識別的不同的抗原表位、對CD4+T細胞不同的分化偏向等層面來實現(xiàn)不同的免疫應答。
　　目的:
　　比較HLA-DR*0803/1202兩個等位之間的HBV全蛋白表位差異，兩個等位對CD4+T細胞極化效應的差異

3、。
　　材料方法:
　　本課題結合了質(zhì)譜鑒定、微陣列芯片表位作圖及功能實驗等方法。首先利用NCBI確定HBV病毒B、C基因型P、S、X、C蛋白共有序列后，合成HBV核心抗原肽池（長15個氨基酸，重疊10個氨基酸，共41條肽），定制包含P、S、X、C蛋白微陣列芯片（長15個氨基酸，重疊11個氨基酸，共631條肽）。然后用肽池負載基因型HLA-DR*0803及HLA-DR*1202等位的BLCL后，用等滲的檸檬酸酸性緩沖液將細胞

4、表面結合的肽段洗脫下來，經(jīng)過過濾、脫鹽、真空濃縮等處理后進行液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜分析，通過選取IonScore≥20的HBcAg肽段，結合NetMHCIIpan3.0 Server預測工具，選取IonScore≥20且IC50≤500的多肽，并分析肽池來源，確定HLA-DR限制性的HBcAg表位。同時，免疫磁珠法提取純化HLA-DR分子，一方面從HLA-DR分子上將多肽送去質(zhì)譜鑒定，另一方面用HLA-DR分子與定制的微陣列芯片進行檢測、掃描。最

5、后，從質(zhì)譜與芯片檢測的結果中選出其中4條肽（芯片檢測的prec21-35、HBc12-26、質(zhì)譜鑒定的HBc82-96、不應答對照HBc42-56）來觀察4例同型HLA-DR慢性HBV患者的T細胞應答實驗。
　　結果:
　　1.質(zhì)譜鑒定結合NetMHCIIpan3.0 Server預測，我們發(fā)現(xiàn)HLA-DR*0803限制性的有HBc17-31,HBc22-36,HBc27-41, HBc82-96,HBc87-101,HBc

6、92-106, HBc117-131,HBc122-136等8條，HLA-DR*1202限制性的有HBc17-31，HBc22-36，HBc27-41，HBc82-96，HBc87-101，HBc92-106，HBc122-136，HBc137-151，HBc142-156等9條。相同的有7條。
　　2.從提取純化BLCL表面的HLA-DR分子上分離得到肽中，質(zhì)譜鑒定只發(fā)現(xiàn)了2條HBcAg肽，但我們發(fā)現(xiàn)了數(shù)百條源自熱休克蛋白、轉鐵

7、蛋白受體蛋白1、組織蛋白酶D、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑等數(shù)十個蛋白的人自身抗原肽。
　　3.從HLA-DR分子與微陣列芯片進行檢測結果中，發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1*0803限制性的206條，HLA-DRB1*1202限制性的169條，總共260條，因其中有115條是相同的。其中HBcAg肽分別為31及28條，23條是相同的。芯片掃描結果與質(zhì)譜分析結果相比，HBc82-96，HBc87-101，HBc92-106，HBc137-151，HB

8、c142-156等肽段在芯片中對應位置中沒有熒光值，已知的8條HBcAg表位，只有HBc147-156不在芯片結果顯示區(qū)域。
　　4.我們收集了9例慢性HBV患者的PBMC，檢測得到基因型HLA-DRB1*0803及DRB1*1202陽性的病人各2例(2/9)。用prec21-35、HBc12-26、HBc42-56、HBc82-96對篩選的4例慢性HBV患者進行應答實驗發(fā)現(xiàn)，HBc12-26刺激在兩例患者中出現(xiàn)了強烈IFN-γ釋

9、放反應，1例未出現(xiàn)明顯應答反應，1例未做該肽的刺激實驗。其余肽都未出現(xiàn)明顯的T細胞應答反應。此外，用HBcAg全肽池刺激比運用單條肽刺激明顯產(chǎn)生強烈的IL-17釋放反應。
　　結論:
　　表位肽芯片效果相對較好，質(zhì)譜分析可靠，結合生物信息方法的輔助，更具有目的性;HBc12-26為HLA-DR*0803/1202共同的Th1表位，HBc42-56為HLA-DR*1202等位特異的Th2表位，HBcAg肽池中存在HLA-DR*