血管生成素作用機制探索——血管生成素與卵泡抑素的相互作用——血管生成素與rDNA的結(jié)合及其對rDNA組蛋白修飾的影響.pdf

1、血管生成素(angiogenin，ANG)是從結(jié)腸癌細胞HT-29培養(yǎng)基中分離純化的生長因子，因其強有力的促血管生成能力而得名。研究表明血管生成素與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡化密切相關(guān)。目前，對血管生成素生物學(xué)功能的作用機制已有一定的了解，證實血管生成素可以通過激活血管生成必需的多個步驟而促進腫瘤新血管的形成和腫瘤的發(fā)生，包括1)血管生成素可與內(nèi)皮細胞表面的肌動蛋白結(jié)合，從而激活細胞外周的蛋白酶，降解基底膜和胞外基質(zhì)，促進細胞的遷移和侵入

2、其他組織的能力；2)可介導(dǎo)細胞粘著；3)通過激活內(nèi)皮細胞Erk1／2及PKB／Akt通路和平滑肌細胞JNK／SAPK信號傳導(dǎo)途徑從而刺激細胞分裂、分化；4)胞外血管生成素可經(jīng)核轉(zhuǎn)位直接進入內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的細胞核，并最后積聚在核仁區(qū)促進核糖體RNA(rRNA)基因的轉(zhuǎn)錄；5)最近的研究表明，除了內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞外，血管生成素還可經(jīng)核轉(zhuǎn)位進入HeLa和PC-3等腫瘤細胞的核仁區(qū)，促進rRNA轉(zhuǎn)錄和核糖體的形成、直接刺激腫瘤細胞的增

3、殖和腫瘤生成。 基于蛋白質(zhì)相互作用在生命活動中扮演的重要角色，推測關(guān)鍵蛋白質(zhì)的相互作用必定介導(dǎo)或調(diào)節(jié)血管生成素促進的腫瘤血管生成及腫瘤細胞增殖等生物學(xué)過程，但是目前對血管生成素相互作用蛋白質(zhì)的了解較貧乏。為探索血管生成素功能活動中的蛋白質(zhì)相互作用情況，本實驗室曾用酵母雙雜交技術(shù)對人心肌cDNA文庫和肝cDNA文庫進行了篩選，獲得了21個可能與血管生成素相互作用的候選蛋白質(zhì)，其中包括在細胞分泌、增殖、凋亡等過程起重要調(diào)節(jié)作用的卵泡

4、抑素(Follistatin，F(xiàn)S)。 第一部分：血管生成素與卵泡抑素的相互作用 為確證血管生成素與卵泡抑素間的相互作用的真實性，首先利用體外蛋白沉降實驗對血管生成素與卵泡抑素的相互作用進行了驗證。在大腸桿菌中表達帶組氨酸標簽的卵泡抑素后，將之與血管生成素蛋白在體外反應(yīng)體系中孵育，然后用Ni珠沉降帶組氨酸標簽的卵泡抑素，最后用Western Blot方法檢測沉降復(fù)合物中是否存在血管生成素。結(jié)果顯示血管生成素可同時被Ni珠

5、沉降下來，表明在體外系統(tǒng)中血管生成素可與卵泡抑素直接結(jié)合。 隨后我們研究了血管生成素與卵泡抑素在細胞環(huán)境下的相互作用。首先構(gòu)建了分別標記有藍綠色熒光蛋白(CFP)和黃色熒光蛋白(YFP)標簽的卵泡抑素和血管生成素的真核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至HeLa細胞，激光共聚焦顯微鏡下觀察他們的定位情況。結(jié)果顯示兩融合蛋白在HeLa細胞中單獨表達時均勻分布于細胞核內(nèi)，共表達后兩蛋白呈顆粒狀共定位于細胞核內(nèi)的特定部位，說明兩者在細胞環(huán)境中有相互作用，

6、且相互作用使各自的細胞內(nèi)定位發(fā)生了改變。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)實驗進一步證實了血管生成素與卵泡抑素在HeLa細胞核內(nèi)的相互作用。在確證卵泡抑素與血管生成素的相互作用后，我們進一步研究了卵泡抑素上與血管生成素的作用位點。成熟的卵泡抑素蛋白包含N端結(jié)構(gòu)域和隨后的三個結(jié)構(gòu)非常相似的FS1、FS2和FS3結(jié)構(gòu)域。我們通過PCR擴增得到各種卵泡抑素的缺失突變體基因，在酵母雙雜交系統(tǒng)中檢測各突變體與血管生成素是否有相互作用。結(jié)果顯示，卵泡抑素

7、的FS2和FS3結(jié)構(gòu)域共同介導(dǎo)了卵泡抑素與血管生成素的相互作用。 卵泡抑素一直被認為是一個分泌蛋白質(zhì)，其核定位現(xiàn)象是本研究的一個創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)。為進一步研究產(chǎn)生該現(xiàn)象的機制，本論文采用CFP為熒光標簽，以直觀地觀察蛋白在細胞內(nèi)的定位情況；同時收集細胞培養(yǎng)基上清，Western Blot方法檢測蛋白質(zhì)的分泌情況。為研究生理情況下即帶信號肽的卵泡抑素合成后在細胞內(nèi)的定位情況，首先將帶有信號肽的FS基因與CFP基因融合并在HeLa細胞中表

8、達，結(jié)果顯示，卵泡抑素一部分經(jīng)分泌途徑分泌至細胞外，另一部分則定位于細胞核內(nèi)。我們知道，一些蛋白的翻譯可以從不同位置的甲硫氨酸開始，從而導(dǎo)致所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)不同的細胞內(nèi)定位。對卵泡抑素氨基酸序列分析顯示其前端信號肽中有2個甲硫氨酸，分別位于-29位和-8位。將兩個甲硫氨酸分別突變后HeLa細胞內(nèi)表達結(jié)果表明，-29位甲硫氨酸突變后，卵泡抑素不能分泌出細胞，全部定位于細胞核內(nèi)；而-8位甲硫氨酸突變后，蛋白則全部經(jīng)分泌途徑分泌至細胞外?？梢?，

9、卵泡抑素可從其信號肽中的不同甲硫氨酸開始翻譯，導(dǎo)致蛋白細胞內(nèi)的不同定位。隨后我們對-29位突變體與血管生成素的相互作用進行了共定位和FRET研究。結(jié)果顯示，兩蛋白呈顆粒狀共定位于細胞核內(nèi)的特定部位，F(xiàn)RET實驗則再次證實了兩蛋白的核內(nèi)相互作用。以上結(jié)果清楚表明，從-8位甲硫氨酸開始翻譯的卵泡抑素進入細胞核內(nèi)，并與核內(nèi)的血管生成素發(fā)生相互作用。為確定卵泡抑素蛋白核定位序列，用PCR技術(shù)擴增得到多個卵泡抑素的缺失突變體，將這些突變體基因與C

10、FP基因融合并在HeLa細胞中表達，激光共聚焦顯微鏡下觀察各融合蛋白的細胞內(nèi)定位情況。結(jié)果表明，卵泡抑素的FS1結(jié)構(gòu)域N端的64-100位氨基酸在卵泡抑素進核過程中發(fā)揮重要作用。 隨后對卵泡抑素與血管生成素相互作用的生物學(xué)意義進行了研究。已知血管生成素可與ABE序列結(jié)合并促進ABE的啟動子活性。卵泡抑素與血管生成素的核內(nèi)相互作用使我們有理由推測卵泡抑素可能對血管生成素的促轉(zhuǎn)錄活性有調(diào)節(jié)能力。為此，本論文利用ABE-熒光素酶報告系

11、統(tǒng)對該推測進行了驗證。結(jié)果表明，ABE序列在檢測啟動子活性的質(zhì)粒pGL3E中表現(xiàn)出啟動子活性，熒光素酶表達量約為pGL3E空質(zhì)粒組的3.14倍；同時表達血管生成素后，熒光素酶表達量顯著升高，約為pGL3E空質(zhì)粒組的8.02倍，說明血管生成素可促進ABE的啟動子活性；卵泡抑素的表達對ABE的啟動子活性沒有顯著影響(約為pGL3E空質(zhì)粒組的3.76倍)；但當卵泡抑素和血管生成素共表達時，熒光素酶表達量顯著降低，約為pGL3E空質(zhì)粒組的2.6

12、9倍，與血管生成素單獨表達組相比有顯著性差異(t檢驗，P<0.05)，說明卵泡抑素與血管生成素的相互作用抑制了血管生成素的促ABE轉(zhuǎn)錄活性。 第二部分：血管生成素與rDNA的結(jié)合及其對rDNA區(qū)組蛋白修飾的影響 為探索確定血管生成素的體內(nèi)rRNA基因(rDNA)區(qū)的結(jié)合序列，我們利用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)研究了血管生成素與rDNA各段區(qū)域的結(jié)合程度。本文首先利用血管生成素的兔多克隆抗體對HeLa細胞的核裂解液進行

13、染色質(zhì)免疫沉淀實驗，以未加抗體沉降組為對照。然后以染色質(zhì)免疫沉淀的產(chǎn)物為模板，用SYBR Green熒光定量PCR法針對rDNA各段(啟動子區(qū)、18S區(qū)、28S區(qū)、ABE區(qū)、基因間區(qū))進行擴增，以確定實驗組和對照組染色質(zhì)免疫沉淀產(chǎn)物中rDNA各段含量的比值，這個比值即間接反應(yīng)了血管生成素與rDNA的結(jié)合程度。結(jié)果顯示，用血管生成素抗體免疫沉淀得到的DNA中，rDNA各段含量與對照組相比均有2-3倍左右的升高，表明血管生成素與rDNA各段

14、均有不同程度結(jié)合。隨后我們進一步研究了用血管生成素處理前后HeLa細胞中血管生成素與rDNA各段的結(jié)合程度的變化。我們將HeLa細胞分為兩組，一組外加血管生成素處理，另一組未處理為對照，兩組用等量血管生成素抗體進行染色質(zhì)免疫沉淀實驗，熒光定量PCR法檢測兩組染色質(zhì)免疫沉淀產(chǎn)物中rDNA各段的含量的比值。結(jié)果表明，與未處理組相比，血管生成素處理后其與rDNA各段的結(jié)合均有4倍左右的升高，從而進一步證明了血管生成素與rDNA的結(jié)合。

15、 隨后我們對血管生成素與rDNA整段結(jié)合的意義進行了探討。已有研究表明，許多rRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子都可通過影響rDNA不同區(qū)域組蛋白乙酰化和／或甲基化的程度，從而調(diào)節(jié)rRNA的轉(zhuǎn)錄。另外一些與rDNA整段結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，如UBF也具有調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。因此，我們推測血管生成素與整段rDNA的結(jié)合也可能影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。我們?nèi)匀贿\用染色質(zhì)免疫沉淀法，研究了血管生成素對rDNA區(qū)各段組蛋白H4乙酰化程度及H3第9位賴氨酸(H3K9)二甲基

16、化程度的影響。首先我們構(gòu)建了表達血管生成素mRNA反義鏈的HeLa細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株(轉(zhuǎn)染空載體為對照)，從而抑制內(nèi)源血管生成素的表達。然后分別用乙?；疕4抗體和H3K9二甲基化抗體對血管生成素抑制組與對照組進行染色質(zhì)免疫沉淀，熒光定量PCR法測定兩組染色質(zhì)免疫沉淀產(chǎn)物中rDNA各段含量的比值，該比值即反應(yīng)了rDNA各段H4乙酰化和H3甲基化程度的改變。結(jié)果表明，抑制血管生成素蛋白表達的HeLa細胞株rDNA各段H4乙?；潭染鶞p低，為對照

17、組的0.5倍左右；rDNA各段H3K9二甲基化程度均有輕弱的升高，約為對照組的1.2-1.7倍不等。H4的乙?；纱龠M常染色質(zhì)的形成和轉(zhuǎn)錄的進行，而H3K9二甲基化作用則相反。因此我們推測血管生成素可能通過促進H4乙?；?、減弱H3K9二甲基化程度而改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，從而促進rRNA轉(zhuǎn)錄。 基于以上兩部分研究結(jié)果，我們得出如下結(jié)論： 1.從信號肽上的第二個AUG開始翻譯的卵泡抑素進入細胞核內(nèi)，與核內(nèi)的血管生成素相互作用。