基于中空纖維細胞捕獲法和中空纖維液相微萃取法研究白芷中香豆素類抗癌活性成分及其藥代動力學.pdf

1、目的：
　　建立中空纖維細胞捕獲-高效液相色譜法（Hollow fiber cell fishing with high performance liquid chromatography，HFCF-HPLC）對白芷中香豆素類成分進行體內(nèi)外抗癌活性成分篩選和鑒定；建立中空纖維液相微萃取-高效液相色譜法（Ho llo w fibe r liquid phase microextraction with HPLC，HFLPME-HPL

2、C）對白芷中篩選出的香豆素類活性成分進行體內(nèi)外含量測定及藥代動力學研究；結合香豆素類成分的抗癌活性篩選、鑒定、含量測定及多組分藥動學，溝通白芷中香豆素類抗癌活性成分在體內(nèi)外的關系，初步尋找真正抗癌的香豆素類成分，為闡明白芷中香豆素類的抗癌藥效物質(zhì)基礎提供理論基礎和試驗依據(jù)。
　　方法：
　?。?）對可能影響 HFCF-HPLC法的的各種因素，如分別種植于纖維內(nèi)壁上的人卵巢癌細胞SKOV-3，人腎癌細胞ACHN，人肝癌細胞He

3、pG-2的生長狀態(tài)、存活率、乙醇濃度對HepG-2細胞存活率的影響、纖維活性中心或培養(yǎng)液對篩選結果的影響、篩選出的活性成分保留時間和相對峰面積的重現(xiàn)性等，進行考察和優(yōu)化。在最佳HFCF-HPLC條件下，以補骨脂素、佛手苷內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素和異歐前胡素作為模型化合物，將分別種植3種癌細胞的中空纖維或充滿HepG-2細胞膜、細胞器混懸液的纖維插入白芷醇提液、水煎液及含藥血漿或含藥肝、腎組織勻漿中，對白芷中的香豆素類成分進行體內(nèi)外活性

4、成分篩選和鑒定，初步明確香豆素類成分與3種癌細胞的結合能力。（2）對影響HF LPM E-HPLC法的因素，如萃取劑種類及其比例、樣品相 pH、萃取時間和轉(zhuǎn)速等，進行條件優(yōu)化，對該法的線性范圍、檢測限、定量限、精密度和準確度，進行方法學考察。在最佳 HFLPM E-HP LC條件下，以補骨脂素、佛手苷內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素和氧化前胡素作為模型化合物，利用HFLPM E-HP LC法對白芷中篩選出的抗癌活性成分，特別是微量活性成分，進

5、行含量測定；并用該法對白芷灌胃給藥后的多成分藥代動力學進行研究。結合白芷香豆素類成分的抗癌活性篩選、鑒定、含測及多組分藥動學研究的結果，探討白芷在體內(nèi)真正起效的香豆素類抗癌活性成分。
　　結果：
　　在最佳HFCF和HFLPME偶合HPLC法實驗條件下，對白芷中香豆素類成分進行研究，可以得出：（1）白芷藥材中與3種癌細胞結合的香豆素類成分至少有花椒毒酚、花椒毒素、補骨脂素、佛手苷內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素和異歐前胡素，其中能

6、夠定量的香豆素類成分有補骨脂素（1.36μg/g）、佛手苷內(nèi)酯（3.05μg/g）、氧化前胡素（22.30μg/g）、歐前胡素（7.78μg/g）和異歐前胡素（2.83μg/g）；（2）白芷口服灌胃給藥后，體外篩選出的7種香豆素類成分均能吸收入血，之后測得含藥血漿中補骨脂素、佛手苷內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素和異歐前胡素的Cmax（The mean peak concentration）分別是0.36、0.23、0.08、1.20和0.4

7、7μg/mL，其中作用于ACHN和 HepG-2細胞的成分僅有花椒毒酚、花椒毒素、佛手苷內(nèi)酯和歐前胡素；（3）在含藥腎組織中能檢測到活性成分有補骨脂素（0.72μg/g）、佛手苷內(nèi)酯（0.46μg/g）、歐前胡素（0.22μg/g）、異歐前胡素（0.62μg/g）以及花椒毒酚和花椒毒素，其中僅花椒毒酚、花椒毒素、佛手苷內(nèi)酯和歐前胡素能作用于ACHN細胞；（4）在含藥肝組織中能檢測到活性成分有氧化前胡素（1.03μg/g）、歐前胡素（0.

8、41μg/g）、異歐前胡素（0.10μg/g）以及花椒毒酚和花椒毒素，僅有花椒毒酚和花椒毒素能與HepG-2細胞作用；（5）利用HFLPM E-HP LC法對白芷口服灌胃后的多成分藥代動力學進行研究，同時測定其藥代動力學參數(shù)。
　　結論：
　　HFCF和HFLPME偶合HPLC法成功應用于白芷中微量香豆素類化合物的抗癌活性成分篩選、定性、含量測定及多成分藥代動力學研究。在本實驗條件下，白芷在體外篩選出的抗癌香豆素類成分是花椒

9、毒酚、花椒毒素、補骨脂素、佛手苷內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素和異歐前胡素，它們與細胞的結合能力與其在白芷中的含量無關；體內(nèi)篩選結果與體外篩選結果有一定的差異，血漿中
　　能夠與 ACHN細胞和 HepG-2細胞作用的是花椒毒酚、花椒毒素、佛手苷內(nèi)酯和歐前胡素，腎組織中僅花椒毒酚、花椒毒素、佛手苷內(nèi)酯和歐前胡素能與ACHN細胞作用，肝組織中只有花椒毒酚和花椒毒素能與 HepG-2細胞作用，且篩選出的活性成分在相應的靶組織可以保持一定有

10、效濃度，由此可見，白芷中的微量香豆素類成分具有抗腎癌 ACHN細胞和肝癌 HepG-2細胞的作用；但5種香豆素類成分在體內(nèi)的達峰時間相似，長期服用白芷藥材可能會引起毒性成分的累積。另外，HFCF和 HFLPME偶合 HPLC法可用來研究中藥中抗癌生物活性成分，特別是微量活性成分。HFCF和 HFLPME的結合為我們研究中藥抗癌活性的藥效物質(zhì)基礎提供一個新思路和新方法。
　　本課題承蒙國家青年科學基金“中空纖維/石墨烯/有機溶劑固-