COX-2抑制劑(塞來昔布)對(duì)尿毒癥腹膜透析大鼠淋巴管形成及腹膜功能的影響.pdf

1、背景和目的：腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)因其具有居家操作方便、血源性疾病感染性小、花費(fèi)少、心血管事件發(fā)生率較低、保存患者尿量、保護(hù)殘余腎功能等優(yōu)點(diǎn)成為尿毒癥患者的首選治療方法,但隨著透析時(shí)間的延長,患者的腹膜功能將逐漸喪失,超濾量將逐漸減少,直至超濾衰竭(ultrafiltration failure,UFF)的發(fā)生。腹膜血管表面積的增大及間質(zhì)淋巴系統(tǒng)回吸收增多是超濾衰竭發(fā)生的主要原因之一。新生血管(angi

2、ogenesis)致超濾衰竭在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究中均已得到證實(shí),并有廣泛研究;但是淋巴管的形成(lymphangiogenesis)對(duì)超濾衰竭的影響研究因缺乏特異性的標(biāo)志物而相對(duì)滯后。隨著近年一些淋巴管特異標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn),推動(dòng)了淋巴管新生的研究,目前其研究地位已等同于新生血管的研究。
　　 環(huán)氧化酶-2(COX-2)是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素過程中的重要限速酶。近年來大量研究表明,COX-2是參與血管新生的重要因子之一,其在靜息狀

3、態(tài)下不表達(dá)或很少表達(dá),但是在一些刺激因素如細(xì)胞因子、生長因子及腫瘤刺激因子等影響下其表達(dá)會(huì)明顯升高。高表達(dá)COX-2可以通過其產(chǎn)物前列腺素E2(PGE2)與EP1結(jié)合,從而進(jìn)一步激活Her-2/neu蛋白的酪氨酸激酶,引起VEGF-C的表達(dá)上調(diào);采用基因沉默的方法,使COX-2的基因表達(dá)沉默,可以看到VEGF-C的顯著下調(diào),說明在VEGF-C的合成過程中,COX-2起到了重要的調(diào)節(jié)作用。
　　 VEGF-C是機(jī)體重要的淋巴因子之

4、一,其功能因結(jié)合受體的不同而有交叉。VEGF-C在體內(nèi)通過與VEGFR-2結(jié)合誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生而引起血管生成作用,且較VEGF作用持久;同時(shí)VEGF-C與VEGFR-3的高親和力作用,具有強(qiáng)大的淋巴管生成作用,使VEGF-C的促淋巴管生成作用成為主導(dǎo),此已成為現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)。
　　 LYVE-1(lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor)即淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞透明質(zhì)酸受體,

5、由于特異性好,可準(zhǔn)確區(qū)分毛細(xì)淋巴管與毛細(xì)血管,是比較可靠的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物。目前有研究證實(shí)在多種腫瘤組織中COX-2、VEGF-C表達(dá)與微淋巴管的形成有關(guān),且二者呈正相關(guān)。應(yīng)用COX-2選擇性抑制劑卻可以抑制PGE2、PG12及VEGF-C mRNA及蛋白水平的表達(dá)。尿毒癥腹膜透析患者,因腹膜腔長期接觸非生物相容性腹透液,致體內(nèi)新生血管的生成及腹膜問質(zhì)/淋巴回吸收系統(tǒng)增加與腫瘤的發(fā)生具有相似的生理病理過程,所以COX-2與VEGF-

6、C二者在長期腹膜透析患者中也可能有一定的表達(dá),并存在一定的相關(guān)性。所以我們構(gòu)建尿毒癥腹膜透析大鼠模型,以LYVE-1作為淋巴管的標(biāo)記物,檢測(cè)COX-2、VEGF-C的表達(dá)及應(yīng)用COX-2抑制劑(塞來昔布)后對(duì)其表達(dá)和對(duì)淋巴管生成以及腹膜功能的影響。
　　 方法：清潔級(jí)SD大鼠均為雄性,共48只,體質(zhì)量為180-200g。共分為5組:A:正常對(duì)照組(n=8只),B:假手術(shù)組(n=8只),C:尿毒癥非腹透組(n=8只),D:4.25

7、％腹膜透析組(PD組,n=16只),其中D組大鼠各選取8只分為D1(PD2周)和D2(PD4周)組。E:PD+塞來昔布干預(yù)組(n=8只)。A組大鼠不進(jìn)行任何處理;B組大鼠行雙側(cè)腎包膜的剔除術(shù):C組行5/6腎臟切除術(shù):D、E組按3ml/100g BW從大鼠頸部腹透管注入4.25%腹透液,保留時(shí)間2小時(shí),規(guī)律腹膜透析;E組在規(guī)律腹透期間,每日每只按20mg/kg BW塞來昔布溶液灌胃,連續(xù)給藥,直至腹透第28天結(jié)束。1)采用免疫組織化學(xué)方法

8、檢測(cè)大鼠腹膜組織中COX-2、VEGF-C蛋白表達(dá)及淋巴管密度(LVD)變化,并進(jìn)行相關(guān)性分析。2)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)各組腹膜組織COX-2、VEGF-C、LYVE-1 mRNA表達(dá)量,并分析各組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3)正常組、PD2周、PD4周組以及E組大鼠處死前行腹膜平衡實(shí)驗(yàn)(PET),準(zhǔn)確計(jì)算凈超濾量(UF)、腹透液4h與O h糖比值(D/D0);采用HE和Masson染色,光鏡下觀察不同透析時(shí)間壁層腹膜組織結(jié)構(gòu)形

9、態(tài)變化,分析塞來昔布應(yīng)用對(duì)腹膜功能的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.與正常組相比,假手術(shù)組大鼠腹膜組織COX-2和VEGF-C mRNA、蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),尿毒癥非腹透組、4.25%腹透組COX-2和VEGF-C mRNA、蛋白表達(dá)量均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)意義(均P＜0.05);與尿毒癥非腹透組相比,4.25%腹透組COX-2和VEGF-C mRNA、蛋白表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0

10、5);與4.25%腹透組相比,PD+塞來昔布干預(yù)組COX-2和VEGF-C mRNA明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。
　　 2.與正常組大鼠相比,假手術(shù)組大鼠腹膜組織LVD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),尿毒癥非腹透組、4.25%腹透組LVD值明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與尿毒癥非腹透組相比較,4.25%腹透組LVD值明顯升高,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與4.25%腹透組相比,PD+塞

11、來昔布干預(yù)組LVD值顯著降低,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.相關(guān)性分析顯示,蛋白水平上COX-2的表達(dá)量與VEGF-C呈正相關(guān),VEGF-C的表達(dá)量與LVD呈正相關(guān),COX-2的表達(dá)量與LVD呈正相關(guān)。
　　 4.與正常對(duì)照組相比,HE染色示PD2周和PD4周模型組壁層腹膜間皮細(xì)胞脫落、間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤,纖維裸露,4周模型組較2周模型組明顯;Masson染色可見PD2周和PD4周組腹膜有大量膠原纖維

12、的沉積,致密層增厚,以PD4周組顯著,并伴有超濾量的下降和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量的增加(P＜0.05)。塞來昔布干預(yù)組與PD4周模型組相比,腹膜厚度明顯減輕、超濾量增加及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量下降,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.體內(nèi)尿毒癥環(huán)境和高糖腹透液可以上調(diào)腹膜組織COX-2、VEGF-C表達(dá)及淋巴管生成;
　　 2.COX-2抑制劑(塞來昔布)可抑制尿毒癥腹膜透析大鼠腹膜淋巴管的形成,可能是