NK細胞產生生長促進因子的功能及機制研究.pdf

1、本文主要從探究生長促進因子在NK細胞組織特異性功能和促進NK細胞發(fā)育和成熟過程中的作用機制和轉錄調控機制方面展開研究，獲得如下結果:
　　本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 NK細胞產生生長促進因子促進胚胎發(fā)育
　　本研究通過高通量基因芯片差異分析子宮trNK細胞和外周血NK細胞，篩選鑒定子宮trNK細胞組織特異性功能分子。通過熒光定量PCR、免疫熒光和流式內標技術檢測分析子宮trNK細胞產生生長促進因子(

2、Growth-promoting factors，GPFs)的能力，包括多效生長因子(Pleiotrophin，PTN)、骨生成誘導因子(Osteoglycin，OGN)和骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)。通過絨毛外滋養(yǎng)層細胞與子宮trNK細胞共培養(yǎng)體系研究子宮trNK細胞產生GPFs的調控機制。最后通過檢測臨床反復流產病人的子宮trNK細胞分泌GPFs能力確定其與胚胎早期發(fā)育相關性，進一步通過Ptn-/-Ogn-/-Spp1

3、-/-小鼠確認子宮trNK細胞分泌生長促進因子促進胚胎早期發(fā)育的重要生理意義。通過上述研究方案取得了如下結果:
　　1.基因芯片差異分析子宮trNK細胞和外周血NK細胞
　　差異分析子宮trNK細胞和外周血NK細胞的基因芯片數(shù)據(jù)，結果顯示子宮trNK細胞與外周血NK細胞功能分子存在顯著差異，子宮trNK細胞特異性高表達PTN、OGN和OPN等對胚胎早期發(fā)育非常重要的生長促進因子。
　　2.子宮trNK細胞分泌生長促進因

4、子PTN，OGN和OPN
　　定量PCR、免疫熒光、流式內標檢測結果均驗證基因芯片結果，子宮trNK細胞相較于外周血NK細胞特異性產生生長促進因子PTN、OGN和OPN。
　　3.HLA-G誘導NK細胞分泌生長促進因子
　　建立絨毛外滋養(yǎng)層細胞與子宮trNK細胞共培養(yǎng)體系模擬體內子宮trNK細胞微環(huán)境，結果顯示絨毛外滋養(yǎng)層細胞可以促進子宮trNK細胞產生生長促進因子。細胞干擾和抗體阻斷實驗及721.221-HLA-G細

5、胞系共培養(yǎng)實驗結果均提示，絨毛外滋養(yǎng)層細胞過表達的HLA-G分子可以促進子宮trNK細胞產生生長促進因子。
　　4.反復流產病人NK細胞分泌生長促進因子能力顯著降低
　　分析反復流產病人子宮trNK細胞，結果顯示病人該細胞數(shù)量以及產生生長促進因子能力相較正常人均顯著減少。該結果提示，子宮trNK細胞產生生長促進因子能力與正產妊娠密切相關。進一步研究發(fā)現(xiàn)發(fā)育異常的胚胎相較于正常發(fā)育胚胎的HLA-G分子表達顯著降低。
　　

6、5.Ptn-/-Ogn-/-Spp1-/-小鼠胚胎發(fā)育受限
　　分析Ptn-/-Ogn-/-Spp1-/-小鼠胚胎發(fā)育情況，結果顯示生長促進因子聯(lián)合缺陷小鼠子宮trNK細胞產生生長促進因子能力缺陷后，孕鼠胚胎發(fā)育受限，體重、體長值均顯著降低。該結果提示子宮trNK細胞可以產生PTN、OGN等生長促進因子促進胚胎早期發(fā)育。
　　綜上所述，該研究通過人轉錄組基因芯片，比較了子宮NK細胞和外周血NK細胞的功能基因差異，發(fā)現(xiàn)早期妊娠

7、中CD11b-CD27-子宮NK細胞高表達PTN、OGN等對胚胎早期發(fā)育非常重要的生長促進因子。胚胎來源的絨毛外滋養(yǎng)層細胞表達的HLA-G與子宮trNK細胞相互作用，誘導NK細胞大量表達生長促進因子，促進胚胎發(fā)育。反復流產病人中子宮trNK細胞表達生長促進因子的能力顯著下降，不能支持胚胎早期的正常發(fā)育。該研究不僅豐富了NK細胞的功能，而且為臨床治療胚胎生長受限和反復流產等相關疾病提供新的思路。
　　第二部分 PBX1通過調控生長促

8、進因子轉錄促進NK細胞在骨髓發(fā)育成熟
　　本研究從NK細胞進化中關鍵分子保守性的角度篩選鑒定調控NK細胞發(fā)育和成熟的關鍵轉錄因子PBX1，并且通過定量PCR，Western blotting，流式內標技術方法檢測分析人NK細胞體外分化擴增體系不同時間點的細胞和骨髓NK細胞的關鍵轉錄因子PBX1和其潛在靶基因生長促進因子PTN和OGN的表達情況。為了研究關鍵轉錄因子PBX1的調控機制，通過電核轉技術構建NK細胞基因干擾體系，以及通過

9、慢病毒感染構建NK細胞體外分化擴增過程中基因過表達體系，驗證PBX1與生長促進因子的潛在調控相關性。為了進一步研究PBX1調控PTN和OGN的作用機制，利用NK細胞CHIP-Seq技術，熒光素酶報告體系和DNA-pulldown體系確認PBX1轉錄調控PTN和OGN的機制。接下來為了鑒定PBX1對NK細胞發(fā)育和成熟的調控作用，通過構建小鼠骨髓嵌合體模型及條件型Pbx1敲除小鼠模型檢測分析NK細胞的發(fā)育和成熟情況。最后構建Ptn-/-Og

10、n-/-小鼠模型驗證PBX1-PTN/OGN軸對NK細胞發(fā)育和成熟的關鍵作用機制。
　　本研究通過上述研究方案取得了如下結果:
　　1.PBX1是NK細胞高度保守的轉錄因子
　　分析NK細胞關鍵分子基因在不同物種中的保守性，發(fā)現(xiàn)PBX1是NK細胞高度保守的轉錄因子。多種實驗技術檢測結果顯示，人骨髓NK細胞相對T細胞特異性高表達PBX1，而且PBX1在NK細胞發(fā)育早期和成熟期均有較高表達。
　　2.PBX1調控NK

11、細胞表達PTN和OGN
　　生物信息學預測分析結果顯示，PTN和OGN基因啟動子區(qū)富含多個轉錄因子PBX1結合位點。NK細胞干擾和過表達PBX1基因后，流式內標檢測生長促進因子PTN和OGN結果顯示，在NK細胞中PBX1上調生長促進因子PTN和OGN的表達。為了進一步研究PBX1調控機制，在NK細胞中用抗PBX1抗體富集DNA序列的CHIP-Seq分析結果顯示在PTN和OGN基因啟動子區(qū)中分別存在轉錄因子PBX1的特異性結合峰。P

12、TN和OGN基因啟動子區(qū)的熒光素酶報告實驗結果和特異性序列的DNA-pulldown實驗結果均驗證PBX1可以識別特異性序列，并直接結合PTN和OGN基因啟動子區(qū)。
　　3.Pbx1缺陷小鼠NK細胞數(shù)量嚴重減少
　　對比分析小鼠骨髓嵌合體模型中Pbx1基因被干擾的骨髓細胞和未被干擾的骨髓細胞中NK細胞的比例和數(shù)量，結果顯示干擾Pbx1基因表達顯著降低骨髓NK細胞和外周NK細胞的比例和數(shù)量。分析Pbx1條件型缺陷小鼠，Vav1

13、-Cre小鼠介導的造血前體期Pbx1條件型缺陷嚴重影響NK細胞的發(fā)育，導致小鼠骨髓NK細胞和外周NK細胞的比例和數(shù)量顯著下降，與骨髓嵌合體小鼠模型結果一致。Ncr1-Cre小鼠介導的NK細胞成熟期Pbx1條件型缺陷同樣顯著減少成熟NK細胞在骨髓和外周的比例和數(shù)量。該結果提示，PBX1不僅可以調控NK細胞的早期發(fā)育而且對于NK細胞的成熟具有關鍵調控作用。
　　4.PBX1促進骨髓NK細胞末端成熟
　　進一步分析發(fā)現(xiàn)Vav1-C

14、re小鼠和Ncr1-Cre小鼠介導的Pbx1條件型缺陷均可以導致小鼠骨髓CD11b+單陽性NK細胞的比例和數(shù)量顯著減少，從而導致外周CD11b+單陽性NK細胞同樣比例和數(shù)量顯著減少。重組表達的生長促進因子PTN和OGN體內和體外恢復實驗結果顯示，補充的PTN和OGN可以恢復條件型Pbx1缺陷小鼠CD11b+NK細胞的比例和數(shù)量。該結果提示，PBX1通過上調PTN和OGN促進NK細胞自身的末端成熟。
　　5.PBX1-PTN/OGN

15、軸參與NK細胞庫的維持
　　分析Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓和外周CD11b+單陽性NK細胞的比例和數(shù)量，發(fā)現(xiàn)與Pbx1條件型缺陷小鼠結果一致，細胞的比例和數(shù)量均顯著減少。分析小鼠骨髓NK細胞生長促進因子受體的表達，結果顯示小鼠骨髓CD11b+單陽性NK細胞高表達PTN受體RPTP-β。野生小鼠骨髓細胞和Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓細胞混合轉輸實驗結果顯示，少量的野生型小鼠骨髓細胞即可恢復Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓和

16、外周中成熟NK細胞的比例和數(shù)量。重組表達的PTN和OGN體內恢復實驗結果也顯示，補充PTN和OGN可以恢復Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓和外周成熟NK細胞的比例和數(shù)量。該結果提示PBX1通過促進PTN/OGN自分泌支持NK細胞在骨髓的發(fā)育和成熟，即PBX1-PTN/OGN軸參與體內成熟NK細胞庫的形成和維持。
　　6.PBX1-PTN/OGN軸上調T-bet表達
　　分析Pbx1條件型缺陷小鼠和Ptn-/-Ogn-/-小鼠

17、骨髓NK細胞增殖和存活以及遷出骨髓的能力，結果顯示PBX1-PTN/OGN軸可以促進骨髓NK細胞的增殖和遷出骨髓的能力，但不影響NK細胞存活。T-bet作為控制NK細胞末端成熟和遷出骨髓能力的重要檢查點轉錄因子，T-bet表達檢測結果顯示在條件型Pbx1缺陷小鼠和Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓NK細胞中T-bet表達顯著降低，重組表達的PTN和OGN可以顯著恢復缺陷小鼠骨髓NK細胞T-bet的表達。該結果提示，PBX1-PTN/OGN