miR-122靶位基因STAT3調控長鏈非編碼RNA Lethe促進HCV復制的機制研究.pdf

1、研究新發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）含有與宿主細胞微小RNA(microRNA或miRNA)相互作用的調控序列，對HCV在肝細胞中復制和翻譯具有重要的調控作用，這為控制丙型肝炎疾病進展及開發(fā)新型藥物研究提供了新途經(jīng)。
　　本課題以肝臟特異miR-122為切入點，根據(jù)文獻報道及生物信息學分析預測得到與miR-122有特異性結合位點的靶基因STAT3，證實miR-122在Huh-7細胞中靶向作用于STA

2、T3基因的3'-UTR抑制其表達，而HCV競爭結合miR-122可上調STAT3的表達，抑制Ⅰ型干擾素表達，從而抑制細胞抗病毒免疫反應，增強HCV RNA的復制。同時，對LncRNA PCR array法檢測得到STAT3激活時上調最顯著的Lethe基因進行進一步的研究。Lethe，作為“假基因”LncRNA，可被NF-κB（多種蛋白的復合體）或者糖皮質激素受體激動劑激活，調控炎癥信號，遏制炎癥反應。研究發(fā)現(xiàn)Huh-7細胞經(jīng)過STAT3

3、激活因子LIF預處理后，LncRNA-Lethe表達顯著上調。同時，感染HCVRNA的Huh-7細胞中Lethe表達顯著上調，而Lethe基因的沉默可導致HCV復制子復制復制效率降低，證實STAT3可以正向調控Lnc RNA-Lethe基因，促進HCV RNA的復制。轉染Lethe siRNA后，Huh-7細胞內干擾素刺激基因(IFN-stimulated gene，ISGs):PKR，OAS和IRF1蛋白質水平表達量上調，real-t

4、ime PCR檢測結果顯示，其相應的mRNA水平表達量上調。提示RNA-Lethe可通過調節(jié)Ⅰ型IFN的免疫反應，在HCV的復制及致病過程中起到了關鍵的作用。
　　研究獲得了兩個新的發(fā)現(xiàn):1）STAT3可上調Lnc-Lethe表達，促進HCV病毒的復制;2）Lnc-Lethe通過調節(jié)Ⅰ型干擾素反應調控HCV的復制。初步探討了miR-122、STAT3、Lnc RNA-Lethe在HCV復制和宿主免疫應發(fā)之間的相互關系，為HCV的防

5、治提供了理論基礎和新的途徑。
　　主要研究結果:
　　一、miR-122和STAT3的特異結合抑制STAT3的表達
　　生物信息學軟件TrgetScan在線預測發(fā)現(xiàn):STAT3 mRNA和miR-1223'-UTR端堿基(UGAGGU)靶向結合。為了驗證STAT3是否為miR-122的直接靶基因，構建了質粒pGL3-STAT3（包含STAT33'-UTR567bp片段）及pGL3-STAT3-Mu（包含STAT33'-

6、UTR5個突變位點）。pGL3-STAT3質粒分別同miR-122mimic、miR-122inhibitor共轉染Huh-7細胞。利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)對結果進行分析。相對對照組，miR-122 mimic導致STAT3表達降低42.1％，而miR-122 inhibitor則增強STAT3表達(38.4％)。為了進一步驗證miR-122和STAT3的結合靶位，質粒pGL3-STAT3和pGL3-STAT3-Mu分別轉染Huh-7細胞

7、，雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析顯示，相對野生株STAT3質粒，miR-122突變株質粒熒光表達顯著增強(56.2％，P＜0.05)。以上數(shù)據(jù)表明miR-122通過和STAT33'-UTR區(qū)種子匹配序列的特異結合抑制STAT3的表達，提示STAT3是miR-122的直接靶基因。
　　二、HCV RNA可能通過和miR-122的靶向結合，保護或增強STAT3的表達
　　利用復制子pcDNA3.1-RZ-HCV RNA1b(包含HCV1

8、 b型9658 bp)及pcDNA3.1-RZ-HCV RNA1b-Mu(包含HCV1b型9658 bp，HCV5'-UTR miR-122“種子序列”區(qū)3個位點突變)瞬時轉染Huh-7細胞。24h后qRT-PCR檢測miR-122含量發(fā)現(xiàn)，相對突變株， HCV RNA野生株miR-122的量略有減少，但差距并不顯著，這也說明微量的miR-122即可影響HCV RNA的復制。24h后Western blot檢測STAT3蛋白表達發(fā)現(xiàn)，H

9、CV RNA野生株轉染體系中，其表達相對HCV RNA突變株顯著上調。提示HCV RNA可通過和miR-122的靶向結合，保護或增強STAT3的表達。
　　三、HCV RNA通過增強STAT3蛋白表達，抑制IFN-α和IFN-β表達，降低抗病毒應答
　　通常認為STAT3可負向調節(jié)IFN介導的抗病毒反應。STAT3基因的沉默或敲減可激活IFN-α和IFN-β介導的抗病毒反應。本研究在HCV RNA野生株和HCV RNA突變株

10、的瞬時轉染體系中，分別在轉染后0h，4h，8h，12h，24h四個時間點，利用qRT-PCR檢測IFN-α和IFN-β表達。結果顯示，HCV RNA野生株轉染細胞體系中，IFN-α和IFN-β的表達顯著降低，而HCV RNA miR-122突變株和對照組差異不顯著。提示HCV RNA和miR-122的靶向相結合，可增強STAT3蛋白表達，抑制IFN-α和IFN-β表達，從而降低抗病毒應答。
　　四、STAT3的磷酸化促進HCV R

11、NA復制
　　白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)作為STAT3的外源性細胞因子激活劑加入Huh-7細胞培養(yǎng)基，不同孵育時間刺激后轉染染HCVJFH-1質粒，qRT-PCR檢測HCV RNA水平發(fā)現(xiàn)HCV RNA增加和LIF刺激時間相關。不用濃度LIF刺激Huh-7細胞，可不同程度促進HCV RNA復制。同樣，HCV的NS5A和NS3蛋白表達水平顯著增加。STAT3磷酸化抑制劑AG490

12、使細胞內STAT3-Y705水平顯著降低，HCV RNA及蛋白表達也降低。提示STAT3的磷酸化在HCV的復制中扮演了十分重要的角色，可誘導特定基因的表達，在宿主體內創(chuàng)造出有利于HCV復制的環(huán)境。
　　五、Huh-7細胞中磷酸化STAT3可調控LneRNA
　　利用LncRNA PCR array檢測LIF刺激磷酸化STAT3組和空白對照組細胞中的LncRNA表達的差異，差異標準為相對對照組2倍以上的增加或降低。發(fā)現(xiàn)多條Ln

13、cRNA的表達水平發(fā)生了變化。有文獻報道LncRNA Lethe能夠調控Ⅰ型干擾素介導的先天性免疫，而Lethe在磷酸化STAT3的細胞中差異倍數(shù)最顯著，因此選其為研究對象進一步研究。LIF刺激Huh-7細胞后，Lethe mRNA的表達水顯著上調，而AG490刺激后，Huh-7中Lethe表達量顯著下降。為了研究HCV感染能否調控Lethe的表達，對不同分組（HCV感染組、HCV+AG490組、HCV+LIF組以及空白對照組）進行研究

14、。與空白對照組相比較，HCV感染細胞后能顯著上調Lethe的表達（4倍）;在HCV感染的細胞中同時利用AG490抑制STAT3的磷酸化，則Lethe的上調被顯著抑制，甚至低于空白對照組;在HCV感染的細胞中同時利用LIF進一步促進STAT3的磷酸化，Lethe的表達水平進一步上升。實驗結果表明:HCV感染細胞后能通過促進STAT3的磷酸化上調Lethe的表達。
　　六、Huh-7細胞中LncRNA-Lethe的干擾可抑制HCV復制

15、
　　三條Lethe siRNA及對照siRNA分別轉染Huh-7細胞，qRT-PCR結果顯示三條靶向Lethe的siRNA均在不同程度上抑制Lethe表達，其中si-Lethe-3的抑制效果最明顯。Huh-7細胞轉染si-Lethe-3后，再感染HCV JFH-1。相對對照組，HCV RNA水平降低，NS5A和NS3蛋白表達降低。為了進一步確定磷酸化的STAT3通過Lethe促進HCV復制，我們設計了實驗進行研究。實驗分組如下:

16、LIF刺激組、LIF+siRNA-control組、LIF+si-Lethe組和空白對照組。與空白對照組相比較，LIF刺激組能顯著上調HCVNS5A轉錄;LIF刺激同時敲減Lethe后，HCV NS5A轉錄水平顯著下調。結果表明:誘導STAT3磷酸化能夠顯著促進HCV復制，磷酸化的STAT3可能通過上調LncRNALethe促進HCV復制。
　　七、LncRNA-Lethe通過抑制Ⅰ型干擾素介導的免疫應答促進HCV復制
　　

17、在HCV感染的Huh-7細胞中加入Lethe siRNA后，Huh-7細胞內Ⅰ型干擾素分子PKR，OAS和IRF1蛋白表達顯著上調，細胞內相應的mRNA表達水平上調。為進一步確定HCV誘導磷酸化的STAT3在上述Lethe對Ⅰ型干擾素分子的調控中的作用。與空白對照組比較，LIF刺激細胞后能顯著下調Ⅰ型干擾素分子PKR，OAS和IRF1的表達;在LIF刺激的細胞中同時干擾Lethe后，Ⅰ型干擾素分子PKR,OAS和IRF1的表達水平達到最