Fgl2在炎性腸病及腫瘤微環(huán)境中的作用與機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分進行論述：
　　第一部分 Fgl2在炎性腸病中的作用及機制研究
　　結腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在全球惡性腫瘤中位居第三位，全世界每年有超過100萬的新增確診病例。已有相關研究表明，炎性腸病(Inflammatory boweldiseases，IBD)的炎癥程度及病程時間與癌變風險呈正相關，流行病學研究顯示大約20％的IBD患者會在30年內進展為腫瘤，并有50％以上死于腸癌。因此，深入闡明IB

2、D發(fā)生發(fā)展的分子機制，發(fā)展新型的IBD治療策略具有重要的科學意義。
　　IBD包括潰瘍性結腸炎(UC)和克隆恩氏病(CD)，是一組臨床上常見的以慢性腸道炎癥為特征的消化系統(tǒng)疾病。近幾十年來，IBD的發(fā)病率在全世界范圍內逐年升高，因此通過深入研究IBD的發(fā)病機理，開發(fā)新型的IBD免疫治療藥物是目前IBD治療領域的研究熱點。其中，以抗TNF-α單克隆抗體為代表的免疫治療手段在部分CD患者中能夠有效緩解臨床癥狀，但同時也發(fā)現相當大比例的

3、UC和CD患者對抗TNF-α單克隆抗體的治療無效。因此，深入探索IBD發(fā)病過程中腸道粘膜免疫系統(tǒng)中的改變及相關分子機制，將為IBD的治療提供新思路和堅實的理論依據。
　　纖維介素蛋白2（Fibrinogen-like protein2，Fgl2）屬于纖維介素相關蛋白超家族，是一種凝血酶原酶，催化凝血酶原Trombin向凝血酶Trombin的轉化，從而促進凝血級聯(lián)反應的發(fā)生。同時，Fgl2作為調節(jié)性T細胞（Treg細胞）的效應分子，

4、通過抑制T細胞增殖，促進B細胞凋亡，抑制DC細胞的成熟發(fā)揮免疫抑制效應。新近研究發(fā)現，在IBD患者的血漿中，Fgl2的表達升高;同時在活躍期的IBD患者的結腸潰瘍區(qū)檢測到Fgl2的高表達，但Fgl2在IBD發(fā)生發(fā)展中的具體作用及機制仍不明確。因此，我們通過構建DSS誘導的小鼠結腸炎模型，及AOM/DSS誘導的小鼠結腸炎相關性腫瘤(CAC)模型，探討Fgl2在IBD和CAC中的作用，并進一步探討其可能的作用機制。
　　方法:

5、　　1.Fgl2在DSS誘導的小鼠IBD模型中的作用。
　　(1)在WT和Fgl2-KO小鼠中構建DSS誘導的小鼠IBD模型;
　　(2)觀察DSS誘導期間WT和Fgl2-KO小鼠體重下降程度、腹瀉和便血等癥狀;
　　(3)測量DSS誘導周期結束后WT和Fgl2-KO小鼠結腸的長度;
　　2.Fgl2在AOM/DSS誘導的小鼠CAC模型中的作用。
　　(1)在WT和Fgl2小鼠中構建AOM/DSS誘導的小鼠

6、CAC模型;
　　(2)觀察AOM/DSS誘導期間WT和Fgl2-KO小鼠體重的變化;
　　(3)AOM/DSS誘導周期結束后，比較WT和Fgl2-KO小鼠結腸中的腫瘤數量及腫瘤負荷。
　　3.Fgl2在小鼠IBD模型中的表達和定位。
　　(1)在C57BL/6小鼠中構建DSS誘導的小鼠IBD模型;
　　(2)在DSS誘導的不同時間點（第0天、第2天、第4天、第7天）處死小鼠，并測量結腸的長度;
　　

7、(3)對DSS誘導不同時間點的小鼠結腸組織進行切片和HE染色，觀察上皮細胞屏障結構、炎性細胞浸潤等的改變;
　　結果:
　　1.Fgl2在DSS誘導的小鼠IBD模型中發(fā)揮保護作用。
　　(1)相較于WT小鼠， Fgl2-KO小鼠在DSS誘導期間體重下降程度更大、腹瀉和便血等癥狀更嚴重;
　　(2)Fgl2-KO小鼠在DSS誘導周期結束后結腸長度縮短更明顯;
　　2.Fgl2抑制AOM/DSS誘導的炎性腸病相

8、關腫瘤的發(fā)生。
　　(1)Fgl2-KO小鼠在AOM/DSS誘導期間體重下降程度更大;
　　(2)Fgl2-KO小鼠在AOM/DSS誘導周期結束后，結腸組織中腫瘤數量更多、腫瘤負荷更大。
　　3.Fgl2在DSS誘導的IBD模型中的表達和定位。
　　(1)隨著DSS誘導時間的延長，IBD小鼠結腸長度逐漸縮短，上皮屏障結構破壞更加顯著，炎性細胞浸潤增加;
　　(2)給予小鼠DSS誘導后，IBD小鼠結腸組織中膜

9、型Fgl2表達增加;
　　結論:
　　1.Fgl2在DSS誘導的小鼠IBD模型中發(fā)揮保護作用;
　　2.Fgl2抑制AOM/DSS誘導的炎性腸病相關腫瘤的發(fā)生;
　　3.Fgl2在DSS誘導的IBD模型中表達升高，腸道巨噬細胞、DC細胞和Treg細胞是Fgl2的主要來源;
　　4.造血細胞來源的Fgl2在DSS誘導的IBD模型中發(fā)揮保護作用;
　　5.Fgl2通過促進腸道巨噬細胞向M2型極化、抑制其向

10、M1型極化，在DSS誘導的IBD中發(fā)揮保護作用;
　　6.Fgl2直接調控巨噬細胞極化。
　　第二部分 間質來源的Fgl2對腫瘤微環(huán)境的調控作用
　　腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細胞、間質細胞、細胞外基質及由腫瘤細胞和間質細胞分泌的細胞因子構成的一個整體。大量研究表明，腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。
　　Fgl2屬于纖維介素相關蛋白超家族，是一種凝血酶原酶，在多種疾病中高表達于巨噬細胞和內皮細胞表面。它通

11、過催化凝血酶原Trombin向凝血酶Trombin的轉化，促進凝血級聯(lián)反應的發(fā)生。此外，Fgl2作為調節(jié)性T細胞（Treg細胞）的效應分子，通過抑制T細胞增殖，促進B細胞凋亡，抑制DC細胞的成熟等發(fā)揮免疫抑制效應。
　　既往研究表明，Fgl2在多種實體瘤中表達升高，如肝癌、腎癌、結腸癌、乳腺癌、胃癌和卵巢癌等，并通過影響腫瘤細胞生物學功能促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。新近在小鼠膠質瘤的研究中發(fā)現，膠質瘤細胞分泌的Fgl2可以上調腫瘤微環(huán)境中P

12、D-1和CD39等免疫抑制分子的表達，并促進腫瘤微環(huán)境中免疫抑制性的細胞募集，從而促進腫瘤進展。但是，我們通過使用Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)數據庫，對各類腫瘤細胞系中Fgl2的mRNA水平進行分析發(fā)現上皮細胞來源的腫瘤細胞系中Fgl2均為低表達，結合文獻和我們此前在IBD中的研究，Fgl2在多種疾病中主要由免疫細胞表達，提示腫瘤間質細胞來源的Fgl2可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。因此我們

13、通過在Fgl2-KO小鼠中構建小鼠Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma，LLC)皮下移植瘤模型，探討間質細胞來源的Fgl2對肺癌腫瘤微環(huán)境的調控以及在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法:
　　1.間質細胞來源的Fgl2在小鼠LLC皮下成瘤模型中的作用。
　　(1)在WT和Fgl2-KO小鼠中構建LLC皮下荷瘤模型;
　　(2)接種腫瘤細胞后，每3天對腫瘤大小進行測量，并繪制腫瘤生長曲線;

14、　　2.Fgl2對LLC腫瘤微環(huán)境的影響。
　　(1)在WT和Fgl2-KO小鼠中構建LLC皮下荷瘤模型;
　　(2)荷瘤15天后，麻醉并處死小鼠，獲取腫瘤組織，制備腫瘤組織單細胞懸液，流式細胞學分析腫瘤組織中CD45+細胞、TAM(F4/80+CD206+)、DC(CD11c+MHCII+)、MDSC（CD11b+Gr-1+）、Treg(CD4+Foxp3+)和CD8+T（CD3+CD8a+）細胞的比例;
　　(3)

15、 qRT-PCR檢測WT和Fgl2-KO小鼠腫瘤組織中NOS2、Arg1、VEGF和TGF-β的表達;
　　3.Fgl2對CAF細胞活化和功能的調控。
　　(1)在WT和Fgl2-KO小鼠中構建LLC皮下荷瘤模型;
　　(2)荷瘤15天后，麻醉并處死小鼠，獲取腫瘤組織，制備腫瘤組織單細胞懸液，流式細胞學分析腫瘤組織中CAF細胞的比例;
　　結果:
　　1.間質細胞來源的Fgl2促進LLC腫瘤的生長。

16、　　(1)與WT小鼠相比，Fgl2-KO小鼠腫瘤生長明顯減緩;
　　(2)荷瘤21天后，Fgl2-KO小鼠腫瘤重量明顯小于WT小鼠腫瘤重量;
　　(3)在LLC皮下移植瘤模型中，Fgl2來源于腫瘤間質細胞。
　　2.Fgl2促進LLC腫瘤微環(huán)境中MDSC的募集。
　　(1)荷瘤15天后，當兩組小鼠腫瘤大小沒有明顯差異時，流式細胞學檢測發(fā)現Fgl2-KO小鼠腫瘤組織中MDSC比例相較于WT小鼠明顯降低;