微流控和單細胞分選技術在生物醫(yī)學中的應用研究.pdf

1、目的：近年來，隨著微流控技術和二代測序技術的不斷發(fā)展，微流控芯片在生物醫(yī)學領域中的應用越來越廣，而單細胞分析也引起了越來越多的關注。本文首先開發(fā)了一種用于體外抗高血壓藥物評估的仿真微流控芯片裝置；其次，鑒于現有的分離單細胞技術的不足，建立一種鑒定、富集和挑選單細胞的系統(tǒng)。
　　方法：（1）①用軟光刻技術以PDMS為材料制作出內部管道尺寸為長4 cm、寬2 mm、高100μm的PDMS-玻璃微流控芯片。芯片用FN在37℃包被1 h，

2、在芯片上種入HUVECs并培養(yǎng)；②利用一個微流注射泵、一個注射器、一個數字壓力計、接頭和軟管與芯片搭建為一套微流控芯片加壓系統(tǒng)，通過微流注射泵設置流速，數字壓力計顯示壓力，給芯片內培養(yǎng)的內皮細胞施加合適的壓力；③實驗時，在壓力為0 KPa、12 KPa、18 KPa下，分別通入藥物濃度分別為0，50，250，500μmo l/L的培養(yǎng)液，實驗分兩組：第一組加壓時和加壓后都對細胞給藥，第二組只在加壓后對細胞給藥.微流控芯片放入培養(yǎng)箱中，加

3、壓系統(tǒng)其它部分則留在外面；④加壓后收集加壓過程和加壓之后的培養(yǎng)液，做ELIS A用于檢測ET-1釋放，用鼠抗人CD62P抗體和羊抗鼠Alexa Fluor546二抗、Alexa Fluor488 phalloidin、DAPI對細胞進行染色，把芯片置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。（2）①計算機作為整個系統(tǒng)的控制中樞，三軸電缸作為384孔板液體自動分配器，顯微操作儀控制毛細玻璃針的位置，顯微注射泵控制細胞的吸吐，顯微鏡用于拍照和實時顯示。②用

4、C++編寫程序控制系統(tǒng)各個部件，生成第一步384孔板和第二步玻璃微坑操作的圖形用戶界面；③為了實現單細胞的高效富集，用兩個步驟實現富集和挑選功能：第一步，使用384孔板對樣品進行初篩：樣品經預處理后制備成細胞懸液，平均分配到384孔板中，顯微鏡下對孔板每個孔依次成像，用軟件輔助判斷目標細胞所在的孔，并將孔中所有細胞收集；第二步：將第一步收集的細胞平鋪到玻璃微坑上，對整個細胞液滴進行成像，軟件輔助判斷目標細胞在液滴中所在位置，通過顯微操作

5、儀和顯微注射泵控制玻璃針，將目標細胞吸入，并吐出細胞至載玻片上的油滴里；④為了檢驗系統(tǒng)挑細胞的效率，將轉染了RFP熒光蛋白的乳腺癌細胞系MDA-MB-231摻入到乳腺癌細胞系MCF-7的摻雜樣品作為實驗樣品。設置五組實驗，分別將1個、2個、5個、10個和20個MDA-MB-231-RFP細胞摻入100萬個MCF-7細胞中，每組實驗重復5次。將小鼠肝癌腫瘤組織作為樣品，經組織消化后制備成單細胞懸液，在系統(tǒng)上挑取單個肝癌細胞，用全基因組、轉

6、錄組和單細胞甲基化方法對細胞進行擴增、建立文庫并用Illumina Hiseq2500高通量測序平臺進行測序。
　　結果：（1）①使用微流注射泵、電子壓力計、微流控芯片、接頭盒軟管所搭建加壓系統(tǒng)可用于研究內皮細胞對壓力和藥物的響應；②細胞Alexa Fluor488 phalloidin、DAPI染色結果表明壓力越大，F-肌動蛋白細胞骨架被破壞，隨著加入藥物濃度的增加，F-肌動蛋白微絲重新排列；③細胞CD62P和DAPI染色結果表

7、明壓力增加，刺激細胞分泌P選擇素，藥物濃度增加，P選擇素分泌減少；④ET-1檢測實驗表明，內皮細胞釋放ET-1隨著壓力的增加而增加，隨著藥物濃度增加而減少。（2）①所搭建的挑細胞系統(tǒng)可在程序控制下正常工作；②384孔板和第二步玻璃微坑操作的圖形用戶界面可輔助實驗圖像識別，實驗數據保存以及實時顯示功能；③摻雜實驗表明系統(tǒng)挑取單細胞效率可達60％以上；④小鼠腫瘤細胞樣品實驗表明系統(tǒng)可挑取組織消化后單細胞樣品并成功用于全基因組、轉錄組和甲基化