麻瘋樹(shù)核糖體失活蛋白（curcin）的化學(xué)修飾與光譜學(xué)研究.pdf

1、核糖體失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein，簡(jiǎn)稱(chēng)RIPs)是一類(lèi)rRNAN-糖苷酶(EC 3.2．2.22)，可專(zhuān)一水解大鼠28S rRNA的A4324位的N—C糖苷鍵，使核糖體失活從而抑制蛋白質(zhì)的合成。根據(jù)RIPs一級(jí)結(jié)構(gòu)的特征，可將其分成三類(lèi)。其中I型RIPs最主要的一個(gè)生理生化特征就是對(duì)無(wú)細(xì)胞體系的蛋白質(zhì)合成具有強(qiáng)烈抑制作用，該類(lèi)蛋白生化性質(zhì)穩(wěn)定，制備簡(jiǎn)便，可與單克隆抗體等制備免疫毒素，在腫瘤治療和

2、骨髓移植等方面具有廣泛應(yīng)運(yùn)前景。本實(shí)驗(yàn)室從四川麻瘋樹(shù)種仁中分離純化得到一種I型RIPs(curcin)。目前對(duì)curcin的基因克隆及序列分析已經(jīng)作了大量工作，但對(duì)curcin的高級(jí)結(jié)構(gòu)還知之甚少。因此本文在前人研究的基礎(chǔ)上利用特異性的化學(xué)修飾劑對(duì)curcin五種氨基酸進(jìn)行化學(xué)修飾，以其得到與curcin核糖體失活活性相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息。 麻瘋樹(shù)核糖體失活蛋白(curcin)經(jīng)勻漿、浸取、硫酸銨分級(jí)沉淀得粗品，將粗品于Scphade

3、x G-100分子篩層析得純品，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)為單一蛋白帶。通過(guò)無(wú)細(xì)胞體系蛋白合成抑制活性的測(cè)定，結(jié)合熒光光譜和圓二色譜技術(shù)，對(duì)麻瘋樹(shù)核糖體失活蛋白(CUFCin)部分氨基酸殘基進(jìn)行特異性化學(xué)修飾，探討維持curcin活性的必需氨基酸基團(tuán)及修飾對(duì)curcin結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，組氨酸和半胱氨酸的化學(xué)修飾對(duì)curcin活性沒(méi)有影響。色氨酸和賴(lài)氨酸的修飾結(jié)果表明對(duì)這兩種氨基酸的修飾表現(xiàn)了剩余活性對(duì)修飾劑濃度和修飾時(shí)間的依賴(lài)性，隨著

4、修飾時(shí)間的延長(zhǎng)和修飾劑濃度的增大，curcin失活程度增大。最終活性分別下降了50％和100％，表明其為維持curcin活性的重要?dú)埢?80 nm處的發(fā)射光譜最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生紅移，表明對(duì)這兩種殘基的修飾影響了色氨酸的微環(huán)境。精氨酸修飾也表現(xiàn)出了對(duì)修飾時(shí)間和修飾劑濃度的依賴(lài)性，最終curcin的抑制活性完全喪失，內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降，最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生紅移，CD譜發(fā)生顯著變化。表明精氨酸是維持clarcin活性的必需殘基，并且對(duì)空間結(jié)構(gòu)影響較