細胞膜表面糖識別芯片制備及其初步應用的研究.pdf

1、目的: 糖、蛋白質、核酸是涉及生命活動本質的三類重要生物分子。隨著分子生物學及細胞生物學的發(fā)展，糖的諸多生物功能不斷被認識。糖可以以多糖或游離寡糖以及糖復合物的形式參與許多重要的生命活動。此外，還與癌癥、細菌和病毒感染等疾病有著密切的關系，有關糖的研究將成為未來生命科學的中心研究課題之一。 目前，糖生物學研究中要解決的關鍵技術問題是糖鏈結構分析和合成方法的建立。為此，各國科學家都致力于糖鏈結構分析和合成方法學的研究，為糖

2、鏈功能分析提供技術支持，同時糖鏈功能研究又集中在細胞水平上糖鏈的調控和識別機制的研究。 凝集素是一類能與糖專一非共價可逆結合的蛋白，凝集素的最大特點在于它們能識別糖及其復合物中復雜的碳水化合物結構，由于凝集素具有高度的糖結合專一性，它已經(jīng)成為生物科學和臨床科學非常有用的研究工具。目前利用凝集素進行細胞中糖鏈檢測的方法有很多，如凝集素沉淀法、凝集素親和層析法、凝集素親和電泳法、凝集素酶聯(lián)免疫吸附實驗、凝集素印記法等，上述方法存在一

3、個共同的缺點：只能對細胞中提取的糖蛋白進行測定，不能直接對細胞膜上的糖鏈進行分析。國外學者用凝集素芯片只對糖蛋白進行檢測，沒有進行細胞的捕獲，需要對糖蛋白進行提純，步驟繁瑣，成本昂貴，且不能對細胞膜表面的糖蛋白進行直接的檢測。 本研究旨在利用芯片的高通量性，制備一種能夠檢測糖蛋白上的糖鏈和不同組織來源細胞膜表面糖鏈特異性的凝集素芯片。由于該芯片能直接進行細胞捕獲，不需要對細胞膜中的糖蛋白進行提取，成本低，操作簡便快捷。通過檢測芯

4、片上凝集素各點陣所捕獲細胞的熒光強度可以對糖蛋白上的糖鏈進行檢測并對細胞膜表面糖鏈的分布獲得總體的認識，因此，凝集素芯片的研制為觀察和檢測細胞膜表面糖鏈的種類及結構等研究建立了一個新的技術平臺。 方法: 1、凝集素芯片的制備分別從芯片載片的不同修飾條件、凝集素在芯片上的固定效果檢驗、凝集素芯片捕獲細胞能力幾個方面進行研究。確定芯片載片的最佳修飾條件、最佳點樣濃度。 2、凝集素芯片的初步應用對凝集素芯片檢測不同組織

5、來源的細胞膜糖鏈特異性進行研究，確定凝集素芯片的應用價值。 3、凝集素芯片的檢測分別對凝集素芯片的穩(wěn)定性、敏感性進行檢測。 結果: 1、凝集素芯片的制備實驗結果表明，凝集素芯片的最佳修飾條件是：硅烷溶液pH=7.2，水化時間20分鐘，芯片載片經(jīng)醛基修飾，凝集素點樣濃度為1.4mg/ml。 2、凝集素芯片的初步應用實驗結果表明，凝集素芯片可以用于檢測不同組織來源的細胞膜糖鏈特異性。 3、凝集素芯片的

6、檢測實驗結果表明，按照上述方法制各的芯片穩(wěn)定性好，敏感度檢測極限為1.8×106個/ml。 結論: 本研究制備了一種能夠檢測糖蛋白上的糖鏈和不同組織來源細胞膜表面糖鏈特異性的凝集素芯片。該芯片穩(wěn)定，重現(xiàn)性高，既具備芯片的高通量性，又避開碳水化合物芯片所面臨的糖立體結構的復雜性。同時，還能直接進行細胞捕獲，不需要對細胞膜中的糖蛋白進行提取，成本低，操作簡便快捷。這為進一步研究細胞膜表面糖鏈結構、分析細胞免疫、細胞信號傳遞及