蠶絲-膠原支架聯(lián)合轉(zhuǎn)染TGF-β3基因的BMSCs用于兔ACL重建的研究.pdf

1、背景：
　　前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)是維持膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)，ACL損傷是運(yùn)動醫(yī)學(xué)科常見的膝關(guān)節(jié)損傷性疾病，如不及時治療，容易引起膝關(guān)節(jié)的半月板、韌帶、關(guān)節(jié)軟骨等的繼發(fā)性損傷，膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定導(dǎo)致軟骨磨損加快，甚至導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。目前，對于ACL撕裂的治療主要是通過重建手術(shù)恢復(fù)膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定，而用于ACL重建的移植物主要有自體肌腱、同種異體肌腱和人工合成移植材料，但這些材料都存在

2、一定的缺陷。比如自體肌腱移植會加重患者損傷、手術(shù)時間延長，術(shù)后造成取材肌腱的功能喪失、康復(fù)時間延長等;異體肌腱移植主要面臨著宿主抗移植物免疫反應(yīng)、可能會使受體有感染傳染性疾病的風(fēng)險，另外其來源困難也是一個需要考慮的問題;人工合成移植材料短期內(nèi)療效較好，但遠(yuǎn)期效果仍面臨著韌帶松弛、力學(xué)強(qiáng)度下降、宿主免疫反應(yīng)引起滑膜炎等問題。理想的ACL替代材料應(yīng)該既能在關(guān)節(jié)腔內(nèi)進(jìn)行韌帶再生，同時植入骨隧道的兩端又能與骨形成良好的腱-骨界面。近年來隨著組織

3、工程的不斷發(fā)展，為制作理想ACL替代材料創(chuàng)造了可能。膠原是肌腱組織的重要組分，因其良好的生物相容性、能為于細(xì)胞提供良好的支持而最先被研究，但提取膠原的力學(xué)性能太差，難以提供有效的力學(xué)支持;脫膠蠶絲具有良好的力學(xué)性能和生物相容性，但其光滑的表面難以為細(xì)胞粘附提供條件。將蠶絲和膠原兩種生物材料進(jìn)行交聯(lián)，既能獲得足夠的力學(xué)強(qiáng)度，又能為干細(xì)胞粘附提供支持。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow mesenchymal stem cells，BM

4、SCs)因取材方便、體外擴(kuò)增快、具有多向誘導(dǎo)分化能力而被廣泛應(yīng)用于組織工程中，是理想的種子細(xì)胞。轉(zhuǎn)化生長因子-β3(transforming growth factor-β3，TGF-β3)是一種具有多種調(diào)節(jié)功能的生長因子，既能調(diào)控軟骨和骨的再生過程，又能調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的分泌、減少組織再生過程中的瘢痕形成，因此是一種理想的調(diào)控組織工程ACL的細(xì)胞生長因子。局部單純應(yīng)用生長因子往往會因其在體內(nèi)的半衰期短而需要多次反復(fù)應(yīng)用或單次大劑量應(yīng)用才

5、能達(dá)到有效濃度，而將生長因子基因轉(zhuǎn)入到種子細(xì)胞，使生長因子在作用部位持續(xù)表達(dá)則解決了這一問題。基于以上研究進(jìn)展，本課題主要從幾個方面進(jìn)行了研究:(1)兔BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定;TGFβ3-Lentivirus慢病毒的構(gòu)建;過表達(dá)TGF-β3的BMSCs細(xì)胞系的構(gòu)建及鑒定;(2)蠶絲-膠原支架的制備及其生物學(xué)性能檢測;(3)蠶絲-膠原支架聯(lián)合轉(zhuǎn)染TGF-β3基因的BMSCs用于兔ACL重建的實(shí)驗(yàn)研究;(4)對蠶絲-膠原支架進(jìn)行改進(jìn)，

6、將羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)負(fù)載于蠶絲-膠原支架兩端，用于兔ACL重建的實(shí)驗(yàn)研究。
　　第一部分 兔BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定;TGFβ3-Lentivirus慢病毒的構(gòu)建;過表達(dá)TGF-β3的BMSCs細(xì)胞系的構(gòu)建及鑒定
　　目的：分離、培養(yǎng)兔BMSCs，通過流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)和三系分化能力鑒定其干細(xì)胞特性;構(gòu)建攜帶TGF-β3基因的慢病毒載體，對BMSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染，建立穩(wěn)定表達(dá)TGF-β3的BMSCs

7、細(xì)胞系。
　　方法：我們通過骨髓腔沖洗、貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的方法獲取兔BMSCs，通過細(xì)胞形態(tài)、流式細(xì)胞學(xué)和三系誘導(dǎo)分化對分離培養(yǎng)的BMSCs進(jìn)行鑒定。構(gòu)建攜帶TGF-β3基因，通過感染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒顆粒收集，經(jīng)過病毒滴度、最佳MOI測定后用TGFβ3-Lenivirus感染BMSCs，用RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測TGF-β3基因在BMSCs中的表達(dá)，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TGF-β3的BMSCs細(xì)胞系。
　　結(jié)果

8、：流式細(xì)胞學(xué)和三系分化檢測，我們培養(yǎng)的骨髓腔沖洗液貼壁培養(yǎng)細(xì)胞為BMSCs;通過構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞得到了病毒滴度為4.85×108TU/ml的病毒液，而病毒在MOI為200時對兔BMSCs的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)100％;通過RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)TGF-β3在穩(wěn)轉(zhuǎn)的BMSCs細(xì)胞系中過表達(dá)。
　　結(jié)論：通過骨髓沖洗液貼壁培養(yǎng)獲取的兔BMSCs具有干細(xì)胞特征和多向分化能力;構(gòu)建的TGFβ3基因慢病毒載體在

9、轉(zhuǎn)染BMSCs后能穩(wěn)定表達(dá)，建立了穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
　　第二部分 蠶絲-膠原支架的制備及其生物學(xué)性能檢測
　　目的：制備蠶絲-膠原文架并對其生物學(xué)性能進(jìn)行分析。
　　方法：通過乙酸抽提的方法從豬跟腱中獲取Ⅰ型膠原，用Na2CO3溶液水浴法對生蠶絲網(wǎng)片進(jìn)行脫膠，將膠原溶液和脫膠蠶絲網(wǎng)片通過冷凍干燥和真空熱交聯(lián)法進(jìn)行交聯(lián)，制作蠶絲-膠原支架材料。用Instron萬能拉力機(jī)對生蠶絲網(wǎng)片、脫膠蠶絲以及蠶絲-膠原支架進(jìn)行生物力學(xué)測定

10、。將BMSCs與蠶絲-膠原支架進(jìn)行共培養(yǎng)，用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察支架表面細(xì)胞的形態(tài)。
　　結(jié)果：蠶絲網(wǎng)片在脫膠前后及整合膠原后，其力學(xué)性能（最大拉力和剛度）無明顯變化;BMSCs與蠶絲-膠原支架進(jìn)行共培養(yǎng)后仍保持著梭形，細(xì)胞狀態(tài)良好。
　　結(jié)論：脫膠、整合膠原等過程未對蠶絲力學(xué)性能造成影響，整合膠原后支架表面形成了多孔、粗糙的表面，更有利于細(xì)胞的粘附和生長。
　　第三部分 蠶絲-膠原支架聯(lián)合轉(zhuǎn)染TGF-β3基因

11、的BMSCs用于兔ACL重建的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：將轉(zhuǎn)染TGF-β3基因的BMSCs種植于蠶絲-膠原支架上，觀察其用于兔ACL重建后關(guān)節(jié)腔內(nèi)韌帶再生和兩端腱-骨愈合的情況。
　　方法：40只12周齡新西蘭大白兔，隨機(jī)平均分為4組進(jìn)行雙側(cè)ACL重建:Auto組，以自體半腱肌肌腱重建ACL;S組，以單純蠶絲-膠原支架重建ACL;S+C組，以BMSCs(轉(zhuǎn)染GFP-Lentivirus，并穩(wěn)定表達(dá)GFP)種植于蠶絲-膠原支架后用于

12、ACL重建;S+C-T組，轉(zhuǎn)染TGF-β3基因的BMSCs種植于蠶絲-膠原支架后用于ACL重建。術(shù)后2周、4周對實(shí)驗(yàn)動物的膝關(guān)節(jié)活動度(ROM)進(jìn)行測量，術(shù)后2周對膝關(guān)節(jié)進(jìn)行MRI掃描，觀察關(guān)節(jié)腔內(nèi)術(shù)后情況;術(shù)后4周、16周兩個時間點(diǎn)分別隨機(jī)處死每組實(shí)驗(yàn)動物的一半，每組標(biāo)本中的5個進(jìn)行組織學(xué)檢測，包括關(guān)節(jié)腔內(nèi)韌帶的組織學(xué)檢測和骨隧道腱-骨愈合情況的組織學(xué)監(jiān)測;每組中余下5個標(biāo)本進(jìn)行micro-CT和生物力學(xué)檢測。
　　結(jié)果：術(shù)后第

13、2周，S組、S+C組、S+C-T組兔膝關(guān)節(jié)ROM明顯優(yōu)于Auto組;而第4周時，各組間ROM未見明顯差異。MRI顯示蠶絲-膠原支架在體內(nèi)水分明顯較自體韌帶多。HE和免疫組織化學(xué)染色顯示S+C-T組在16周時有更好的細(xì)胞排列和細(xì)胞外基質(zhì)沉積;Russell-Movat染色顯示S+C-T組在16周時腱-骨界面形成了典型的生理性腱-骨界面的四層結(jié)構(gòu)，而S組和S+C組在腱-骨界面多形成伸入移植物的硬化骨小梁，而Auto組在腱-骨界面則觀察到了典

14、型的Sharpey's纖維。Micro-CT顯示感興趣區(qū)域(area of interesting，AOI)在4周和16周的骨形成指標(biāo)(BV/TV，BMD)均顯著高于Auto組，這和生物力學(xué)結(jié)果相一致。
　　結(jié)論：轉(zhuǎn)染TGF-β3基因的BMSCs種植于蠶絲-膠原支架后用于兔ACL重建，不僅能獲得較好的關(guān)節(jié)腔內(nèi)韌帶再生，同時能夠達(dá)到良好的腱-骨愈合效果。
　　第四部分 兩端負(fù)載羥基磷灰石的蠶絲-膠原支架用于兔ACL重建的實(shí)驗(yàn)研

15、究
　　目的：用模擬體液結(jié)晶法將HA結(jié)合到蠶絲網(wǎng)片上，將兩端負(fù)載HA的蠶絲-膠原支架用于兔ACL重建的實(shí)驗(yàn)研究，觀察其腱-骨界面的愈合情況。
　　方法：用模擬體液結(jié)晶法將HA結(jié)合到蠶絲網(wǎng)片上，然后將網(wǎng)片和膠原溶液通過冷凍干燥和真空熱交聯(lián)法進(jìn)行交聯(lián)，制作兩端負(fù)載HA的蠶絲-膠原支架材料。24只新西蘭大白兔，隨機(jī)平均分為2組進(jìn)行左側(cè)下肢ACL重建:S組，單純蠶絲-膠原支架用于ACL重建;HA組，兩端負(fù)載HA的蠶絲-膠原支架用于A

16、CL重建。術(shù)后16周處死實(shí)驗(yàn)動物，收集標(biāo)本，對ACL的遠(yuǎn)期效果進(jìn)行評價:每組中6個標(biāo)本進(jìn)行HE和蕃紅-O和免疫組織化學(xué)染色對腱-骨愈合進(jìn)行評價;剩余6個標(biāo)本進(jìn)行micro-CT、生物力學(xué)以檢測以及骨性關(guān)節(jié)程度的評分。
　　結(jié)果：術(shù)后第16周，組織學(xué)染色顯示S組和HA組腱-骨界面可見骨小梁長入移植物內(nèi)，而在HA組骨小梁長入更為明顯，micro-CT矢狀面上顯示骨隧道內(nèi)部有條狀骨形成;免疫組化顯示HA組在腱-骨界面有更多的collag

17、enⅠ和osteocalcin的表達(dá)，而S組有更多collagenⅢ的表達(dá)，說明HA組腱-骨界面骨形成更早、更成熟。HA組Micro-CT顯示感興趣區(qū)域的骨形成指標(biāo)(BV/TV，BMD)均顯著高于S組，與生物力學(xué)結(jié)果相一致。對膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎評價結(jié)果顯示HA組Mankin評分明顯小于S組，進(jìn)一步說明HA組ACL重建后膝關(guān)節(jié)較S組重建后更為穩(wěn)定。
　　結(jié)論：兩端負(fù)載HA的蠶絲-膠原支架用于ACL重建后雖未在腱-骨界面觀察到典型的生理