Hck基因與胚胎心臟發(fā)育及NFATc1基因與心臟發(fā)育缺陷關系的研究.pdf

1、第一部分 目的：探討Hck基因在大鼠胚胎心臟發(fā)育過程中的時空表達規(guī)律、過表達Hck基因?qū)19向心肌細胞分化的影響及過表達Hck對工具細胞功能的影響，從而分析其與心臟發(fā)育的關系。 方法：1)取大鼠胚胎12、15、19d心臟，采用RT-PCR技術(shù)檢測心臟組織中Hck基因mRNA的表達豐度，并應用原位雜交技術(shù)對Hck基因表達進行定位分析。2)構(gòu)建Hck真核表達載體轉(zhuǎn)染入P19細胞，篩選穩(wěn)定表達株并進行DMSO誘導分化方案誘導

2、其向心肌細胞分化，在誘導的第10天觀察心肌細胞的跳動并抽提細胞總蛋白，用Western-b1ot方法檢測cTnI的表達。3)構(gòu)建p56Hck及其突變體的熒光表達載體，并瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞，進行F-actin染色及微管蛋白免疫組化，或應用Phagokinetic track motility assay及體外侵蝕實驗檢測HeLa細胞遷移及侵襲能力的變化。 結(jié)果：1)在胚胎12、15、19d心臟中，Hck基因均有表達，但主要表達于

3、心臟間質(zhì)，在心肌細胞中不表達，其表達隨胚齡增加呈逐漸上調(diào)趨勢(P<0.05)。2)在P19分化第10天，相差顯微鏡下觀察Hck轉(zhuǎn)染組跳動的心肌細胞集落的數(shù)目及面積未有變化，Hck轉(zhuǎn)染組cTnI的表達量與對照組無顯著區(qū)別(P>0.05)。3)過表達p56Hck/p56Hckca能促使HeLa細胞細胞膜突起增多、F-actin及細胞微管蛋白的重新分布，并促進HeLa細胞的遷移及侵襲能力增強。 結(jié)論：Hck基因表達于心臟間質(zhì)而在心肌細

4、胞中無表達，其表達豐度與大鼠胚胎心臟發(fā)育時間有關；Hck的過表達并不影響P19細胞向心肌細胞分化；Hck基因功能可能與心臟間質(zhì)細胞的遷移黏附等功能相關，Hck功能缺陷可能通過影響心臟間質(zhì)細胞的功能而導致先天性心臟病的發(fā)生。 第二部分 NFATcl基因與心臟發(fā)育缺陷關系的研究 目的：探討NFATcl敲除導致小鼠心臟瓣膜及室間隔缺陷的具體原因及在心臟發(fā)育中受NFATcl調(diào)控的下游分子。 方法：1)取經(jīng)genotypi

5、ng驗證的E9.5-E13.5 NFATcl敲除小鼠和野生型小鼠，固定、包埋、切片后應用免疫組化方法檢測凋亡因子Caspase3，細胞增殖標志蛋白PCNA、K167，及FGFR1、RGS10的表達；2)分離并原代培養(yǎng)小鼠胚胎E11.5心內(nèi)膜細胞(ECC)，應用CSA、FK506分別抑制或應用PMA+ionomycin激活ECC細胞中Cacinurin-NFATcl通路后來研究對FGFR1、RGSl0表達的影響；3)預測并克隆FGFR1的

6、內(nèi)含子區(qū)域NFATcl結(jié)合位點，構(gòu)建成Luciferase報告基因系統(tǒng)載體，與NFATcl真核表達載體共轉(zhuǎn)染MEF細胞，分別在培養(yǎng)基含或不含ionomycin的情況下測定熒光素酶活性。 結(jié)果：1)相對于野生型小鼠，NFATcl敲除小鼠心臟開始出現(xiàn)凋亡的時間并無提前，二者均于E12.5開始在心臟發(fā)育中的內(nèi)膜墊區(qū)域出現(xiàn)凋亡，主要位于室間隔膜部及瓣膜位置并在E13.5凋亡達到高峰。然而NFATcl敲出小鼠的凋亡程度重于野生型；2)NF

7、ATcl敲除小鼠胚胎心臟增殖減弱表現(xiàn)在瓣膜形成期，主、肺瓣膜內(nèi)膜細胞缺乏增殖能力；3)FGFR1在NFATcl敲除小鼠胚胎心臟發(fā)育過程中出現(xiàn)兩次下調(diào)，第一次表達的下調(diào)發(fā)生于E10.5，主要集中于動脈干及心內(nèi)膜墊區(qū)域；第二次表達的下調(diào)發(fā)生于E13.5，只位于心臟瓣膜。FGFRl的內(nèi)含子區(qū)域存在著一個NFATcl的結(jié)合位點。應用CSA、FK506分別抑制ECC細胞中Cacinurin-NFATcl通路后FGFR1的表達下調(diào)；應用PMA+io

8、nomycin激活ECC細胞中Cacinurin-NFATcl通路后FGFRl的表達上調(diào)。4)RGSl0在NFATcl-1-小鼠心內(nèi)膜細胞的表達增強；在NFATcl表達減少的ECC細胞，RGS10表達顯著上調(diào)；而在NFATcl表達增多的ECC細胞，RGS10表達顯著下調(diào)。抑制ECC細胞中NFATcl活性會引起RGS10 mRNA的表達上調(diào)；而激活NFATcl活性導致RGS10 mRNA的表達顯著下調(diào)。 結(jié)論：NFATcl基因敲除