間充質干細胞外泌體通過抑制BACH1促進HO--1影響椎間盤退變的機制研究.pdf

1、下腰痛(Low Back Pain，LBP)在臨床上較為常見，是門診患者就診的常見病因之一[1]。下腰痛嚴重影響患者生活質量，并且給社會和個人造成巨大的經濟損失[2]。目前，如腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄癥及退變性側凸等，被公認的是引起下腰痛主要疾病。通過大量的研究證實，這些疾病均與椎間盤退變(Intervertebral Disc Degeneration，IDD)及其繼發(fā)的病理改變有關[3]。下腰痛在中國的發(fā)病率逐年加劇，隨著社會老齡

2、化，腰椎退變性疾病患者亦呈遞增趨勢。目前在臨床上，針對椎間盤疾病，最主要的治療手段仍然是手術治療[4]。手術治療可以有效的緩解臨床癥狀，但是手術并不能從根本上修復已經退變的椎間盤，并且有可能產生嚴重并發(fā)癥，給病人帶來更大的痛苦。因此對椎間盤退變機制及生物治療的深入研究具有十分重要現實意義。
　　椎間盤的解剖結構分為，中央的髓核、外側的纖維環(huán)及上下兩端的終板構成;椎間盤的主要功能為維持正常的脊柱結構，承擔脊柱的生物應力[5]。髓核組

3、織正常的含水量為椎間盤發(fā)揮生理功能、承擔應力的必要前提，椎間盤退變早期的影像學表現，即為MRI下T2加權像上髓核組織含水量減少，由高信號逐漸轉變?yōu)榈托盘柹踔翢o信號[6]。而含水量的減少，目前認為是由于細胞外基質的破環(huán)導致。含水量減少引起椎間高度降低，局部運動節(jié)段不穩(wěn)，最終導致髓核突出，神經根管狹窄等病理變化從而壓迫局部神經引起腰痛[7]。目前不少針對椎間盤退變的臨床研究都是根據其影像學上髓核含水量的變化來判斷椎間盤退變進程的[8]，這也

4、是臨床工作中判斷椎間盤退變的重要指標之一。
　　研究表明，椎間盤髓核細胞凋亡增加，炎癥因子的大量侵入，髓核中細胞外基質(Extracelluar matrix，ECM)的代謝紊亂等是導致其發(fā)生退變的主要原因。大量研究結果證明，而在這些原因之中，髓核細胞外機制合成分解代謝紊亂被認為是最主要的引起椎間盤退變的機制[9]。NP細胞在ECM代謝中起著關鍵作用，可分為兩個方面。關于合成代謝，ECM的主要成分是Ⅱ型膠原(COL-Ⅱ)和蛋白多糖

5、[10]。蛋白聚糖是必不可少的椎間盤的蛋白多糖的組成部分，與大量的硫酸化糖胺聚糖(sGAG)側鏈[11];這些分子使椎間盤具有凝膠特性，使其保持水分和機械支持能力。這些基質基因在IDD的表達下降已被研究者報告，表明在IDD中合成代謝的減少[12，13]。在分解代謝方面，以往的研究表明基質金屬蛋白酶(MMPs)和聚蛋白多糖酶(ADAMTS)在IDD中上調，這是IDD中ECM降解的主要原因。
　　近年來，再生醫(yī)學以及生物治療，成為研究

6、熱點[14]。對于椎間盤退變的生物治療和再生醫(yī)學的相關研究，也聚焦于具有修復及多向分化潛能的干細胞身上。該類治療方法通過注射等手段，將具有修復能力的干細胞直接作用于退變的椎間盤組織，促進椎間盤內細胞數量的恢復以及基質的再生，最終起到改善退變，甚至逆轉退變進程的治療效果[15]。目前，針對椎間盤退變的再生治療手段，以間充質干細胞為主。間充質干細胞具有多向分化潛能、組織替代、調控微環(huán)境、影響局部免疫及炎癥反應等特性，同時間充質干細胞來源多樣

7、，不同來源間多能性存在差異等特性。間充質干細胞相關的再生治療的研究非常廣泛，并且取得了很多積極的結果，然而間充質干細胞治療存在來源獲取難、細胞易衰老、具有潛在致瘤性等弊端，極大地限制了間充質干細胞的再生醫(yī)學研究及應用。所以，基于干細胞治療的局限性，更多的研究者將目光投向間充質干細胞所分泌產生的一種物質——外泌體上。
　　外泌體是由細胞分泌的納米級囊泡，囊泡內包含編碼RNA，非編碼RNA，蛋白質，抗原遞呈因子，以及DNA[16,17

8、]。由于其具有雙層膜結構，能夠很容易地穿透細胞膜達到將內容物進行細胞間轉導的效果，通過傳遞蛋白質和RNA，外泌體可以調節(jié)受體細胞和其他器官的功能、活動[18]。JCI也于2016年做?？瘜ν饷隗w的發(fā)現、作用以及對未來應用上的展望做了系統(tǒng)綜述。目前，外泌體的再生效應，已經在其他組織和器官損傷修復的研究中得到驗證，包括心臟損傷治療、肺部損傷治療、肝臟再生治療、骨折愈合、腦卒中后再生治療等[19,20]。但是間充質干細胞外泌體能夠促進椎間盤退

9、變的修復，其效果與干細胞治療相比優(yōu)勢如何等，目前仍在研究階段，僅有少量報道。因此本課題針對上述情況，擬對間充質干細胞來源外泌體在椎間盤髓核細胞退變過程中的作用進行系統(tǒng)研究，力求通過該研究發(fā)現治療椎間盤退變的新的手段，為今后的再生醫(yī)學相關治療研究打下基礎。
　　第一部分:間充質干細胞外泌體的分離與鑒定
　　目的與方法:采集非開放性股骨骨折外傷患者股骨內的新鮮骨髓標本，按照Percoll密度梯度離心方法，分離和收集有核細胞，在5

10、％的CO2和37℃條件下，使用含15％胎牛血清的DMEN培養(yǎng)基靜止培養(yǎng)，細胞達90％融合時可以傳代。利用流式細胞術、以及誘導分化，鑒定干細胞特性。細胞傳代至P2代后，將間充質干細胞接種于T75以上培養(yǎng)瓶中進行擴增，待細胞融合度達到90％時，更換低外泌體血清培養(yǎng)基，每2天換液收集培養(yǎng)基，連續(xù)收集，對收集到的培養(yǎng)基使用超速離心機多次離心，抽提外泌體。對收集到的外泌體，使用電鏡掃描及Nanosight分析外泌體的性狀，使用Western Bl

11、ot，檢測外泌體中特定的蛋白表達情況，使用融合試驗明確外泌體的融合能力。
　　結果:成功培養(yǎng)出狀態(tài)良好的骨髓來源間充質干細胞7例。流式細胞試驗測得CD29、CD90+、CD44+，CD105-、CD14-，CD34、CD45不表達等干細胞標志物，證明所得細胞符合國際標準。將原代細胞進行成骨及成脂誘導，原代細胞中顯示出明顯的鈣結節(jié)及脂肪滴，證明其多項分化潛能。細胞傳代至P2代后，用低外泌體血清培養(yǎng)基大量培養(yǎng)并收集上清，用超速離心法收

12、集抽提外泌體。用Western Blot方法檢測收集到的外泌體中CD81及CD63的表達情況，同時Nanosight及電鏡檢測外泌體的大小形態(tài)及純度，證明所收集得到的確定為純度較高的外泌體。將所得外泌體用PKH67染料染色并加入到MSC中，結果顯示外泌體可將MSC染色，證明其膜融合能力。
　　結論:完成骨髓間充質干細胞的原代培養(yǎng)，并通過相關試驗驗證，所獲細胞符合間充質干細胞國際標準。傳至P2代后，更換使用低外泌體血清培養(yǎng)基并收集，

13、用超速離心的方法抽提外泌體，并驗證其確為外泌體。
　　第二部分:MSC外泌體對退變椎間盤的作用
　　目的與方法:根據試驗設計，收集滿足條件的人髓核組織進行原代培養(yǎng)。通過CCK-8增殖試驗，驗證所得外泌體是否存在細胞毒性，以及其促進髓核細胞增殖能力。試驗分組:設對照組為超速離心后的上清液作為去外泌體上清作組;設陰性對照組為HEK293細胞按照上述方法培養(yǎng)并收集上清進行超速離心收集得到的外泌體;設空白對照組為超速離心后未培養(yǎng)過細

14、胞的原始培養(yǎng)基;設實驗組為間充質干細胞來源外泌體組。
　　測定各樣本蛋白量，將不同濃度的樣品加入髓核細胞中，培養(yǎng)24h后，使用Western Blot、PCR以檢測處理后細胞外基質分泌表達情況。同上述方法處理，驗證與髓核細胞外基質降解相關MMP、ADAMTS的表達情況，以及髓核細胞外基質合成相關基因的表達情況。
　　使用高通量測序技術，找尋靶基因，分析外泌體對髓核細胞體外退變過程的影響。
　　結果:成功建立體外髓核細胞

15、系5株。通過增殖試驗證明MSC外泌體對NP細胞不僅沒有細胞毒性，試驗結果同時還證明MSC外泌體還具備提高髓核細胞增殖的能力。分組處理后，通過Western Blot、PCR等試驗方法驗證，實驗組的髓核細胞較對照組及陰性對照組中，2型膠原、蛋白聚糖表達量顯著上調，分解代謝相關MMP1、MMP2、MMP7表達雖然沒有顯著下調，但是合成相關的ACAN、COLⅡ、CHSY表達顯著上調。高通量轉錄組測序，證明MSC外泌體處理后NP細胞轉錄組水平基

16、因表達與對照組相比存在顯著差異。
　　結論:獲得正常人髓核細胞系5株。增殖試驗證明MSC外泌體對NP細胞不具備細胞毒性，同時具有提高NP細胞增殖的能力。分組定量處理細胞，并使用Western Blot、PCR方法檢測，發(fā)現間充質干細胞來源外泌體具有促進細胞外基質合成，上調髓核細胞細胞外基質合成酶以及下調細胞外基質降解酶的表達。
　　第三部分:MSC外泌體上調HO-1影響椎間盤退變的機制研究
　　目的與方法:(1)根據高

17、通量RNA測序結果篩選候選靶基因。(2)結合MSC外泌體高通量miRNA測序數據，利用生物信息學分析MSC外泌體中miRNA成分對靶基因的影響。(3)篩選與BACH1結合的、MSC外泌體處理后高表達的miRNA，并對結合進行驗證。(4)研究篩選出的miRNA對BACH1、HO-1表達的影響。(5)明確MSC外泌體通過microRNA對突變BACH1的結合位點的影響。
　　結果:(1)MSC外泌體處理后，NP細胞低氧相關基因表達存在

18、明顯差異。(2)MSC外泌體能夠顯著上HO-1表達,而HO-1抑制性BACH1的表達則顯著下調。進一步的miRNA測序數據顯示MSC來源外泌體中高峰度miRNA均與BACH1存在相互作用，提示其功能可能通過抑制BACH1來發(fā)揮。(3)通過miRNA實時定量PCR檢測發(fā)現外泌體處理后的髓核細胞其BACH1抑制性miR-21、-23、-125、-let7均出現明顯上調。(4)利用miRNA模擬物進行miRNA過表達，結果顯示上述候選miRN

19、A均能不同程度抑制BACH1表達。(5)MSC外泌體中miR-21、-23、-125、-let7能夠直接抑制BACH1的表達，促進HO-1表達，影響椎間盤退變。
　　結論:證實MSC外泌體促進IDD中ECM合成的作用，是通過miRNA等轉錄后調控因子來實現。證實對BACH1存在抑制性的miR-21、-23、-125、-let7，在MSC外泌體處理后上調，發(fā)現了外泌體上調HO-1的作用機制。
　　小結
　　本研究首次發(fā)現

20、了外泌體中所含有的BACH1靶向性miRNA因子能夠改善椎間盤退變。發(fā)現了miR-21、-23、-125、-let7在外泌體處理后的髓核細胞中表達顯著上調，而通過功能學驗證明確了上述miRNA確實能夠引起B(yǎng)ACH1表達的變化，從而引起HO-1活性的增高，促進椎間盤退變的修復。通過上述研究啟發(fā)了關于HO-1的調控機制。在前期針對HO-1修復椎間盤退變的基礎進一步通過MSC來源外泌體豐富了HO-1的調控機制，此外也通過該研究進一步證明了MS