斑馬魚(yú)mmp21基因在胚胎左右不對(duì)稱發(fā)育中作用的初步研究.pdf

1、目的：
　　探討敲低基質(zhì)金屬蛋白酶21(matrix metallopeptidase21，mmp21)基因?qū)Π唏R魚(yú)胚胎左右不對(duì)稱發(fā)育的影響。
　　方法:
　　在斑馬魚(yú)胚胎1~2細(xì)胞期顯微注射嗎啉反義寡核苷酸（morpholino antisense oligonucleotides，MO）敲低mmp21基因的表達(dá)。
　　（1）逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）檢測(cè)m

2、mp21 MO的有效性。
　　（2）利用整胚原位雜交(whole mount RNA in situ hybridization，WISH)檢測(cè)心臟和心外器官（腸道、腦）標(biāo)志物以評(píng)價(jià)斑馬魚(yú)胚胎左右不對(duì)稱發(fā)育情況。
　?。?）通過(guò)觀察活體胚胎心臟、計(jì)數(shù)心率和測(cè)量心室收縮分?jǐn)?shù)(ventricular shortening fraction，VSF)評(píng)價(jià)心臟功能的改變。
　?。?）體視顯微鏡下觀察活體胚胎庫(kù)氏囊泡（Kupff

3、er's vesicle，KV）并拍照，利用Image J測(cè)量KV面積。
　?。?）通過(guò)整胚原位免疫熒光（whole mount in situ immunofluorescence）對(duì)乙酰化微管蛋白（acetylated-tubulin，AC-tubulin）染色以評(píng)價(jià)纖毛變化。
　?。?）通過(guò)WISH檢測(cè)中線屏障標(biāo)志物以觀察中線屏障的改變。
　　結(jié)果：
　　mmp21 MO能有效敲低mmp21基因。敲低mmp

4、21基因?qū)е掳唏R魚(yú)胚胎心臟、腸道以及腦部標(biāo)志物左右隨機(jī)分布，隨著 mmp21 MO濃度的增高，異常比例增高；活體胚胎心臟結(jié)構(gòu)異常，表現(xiàn)為心房、心室左右隨機(jī)分布；心臟功能損害，表現(xiàn)為心率減慢、心室收縮分?jǐn)?shù)減少（P＜0.05）；KV面積變小（P＜0.05），囊泡內(nèi)運(yùn)動(dòng)纖毛數(shù)量減少、長(zhǎng)度變短（P＜0.05）；中線分子屏障lefty1部分或全部缺失。
　　結(jié)論：
　　敲低mmp21基因?qū)е掳唏R魚(yú)心臟和其他心外結(jié)構(gòu)（腸道、腦部）左右不