兩個TetR家族的轉錄因子介導恥垢分枝桿菌藥物抗性調控的分子機制研究.pdf

1、結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一種重要人類傳染病，其產生的抗藥性問題已經引發(fā)了全球范圍的廣泛關注。然而，致病性的結核分枝桿菌生長非常緩慢，感染性極強，目前對其抗藥調控機制的認識仍然十分有限。相比而言，恥垢分枝桿菌（M.smegmatis）生長較快，遺傳操作方法成熟，而且很多基因與結核分枝桿菌高度同源，因此已經成為研究病原性分枝桿菌的基因調控和生理代謝特點的重要模式菌株。本研究以恥垢分

2、枝桿菌為研究對象，發(fā)現(xiàn)了兩個新的Tet家族的轉錄因子，分別正調控恥垢分枝桿菌對利福平和乙胺丁醇藥物的抗性。具體結果如下:
　　(1)Ms4022是恥垢分枝桿菌基因組編碼的一個功能未知的轉錄因子，由199個氨基酸組成，其N端含有一個TetR家族的HTH結構域。通過構建ms4022敲除和超表達重組菌株并測定利福平藥物對它們的最小抑菌濃度(MIC)，結果發(fā)現(xiàn):ms4022敲除菌株的MIC（3.13μg/ml）比野生型菌株的（6.25μg

3、/ml）低2倍，而超表達菌株的MIC（25μg/ml）大約是野生型菌株的4倍。因此，ms4022基因的表達水平顯著影響恥垢分枝桿菌對利福平的抗性。進一步，通過EMSA和DNA足跡實驗發(fā)現(xiàn)，Ms4022在其自身啟動子區(qū)域含有有兩個結合位點:第一個命名為motif1，其長度為19bp，靠近翻譯起始位點;第二個則包含了兩個motif,分別命名為motif2和motif3，它們距離翻譯起始位點都較遠。序列比對分析顯示，這三個motif的5'端9

4、bp序列的同源性很高，具有明顯的保守性。利用Ms4022識別的3個motif在全基因組范圍內搜索恥垢分枝桿菌的啟動子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)Ms4022可廣泛調節(jié)約315個潛在靶基因的表達。有趣的是，這些潛在靶基因中包括有31個運輸相關的基因（占9.84％）。隨后，采用EMSA和ChIP實驗證實Ms4022在恥垢分枝桿菌體內體外能與這些運輸相關基因的靶啟動子序列特異性結合。進一步采用qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，ms4022敲除菌株中絕大

5、部分這些運輸相關靶基因的表達量都明顯下調;相反，ms4022超表達菌株中它們的表達量則顯著上調。進一步的β-半乳糖苷酶活實驗也清楚證明，Ms4022正調控這些基因的表達。最后，通過分別構建這些運輸相關靶基因的超表達菌株并測定生長曲線，結果發(fā)現(xiàn)7個靶基因的超表達能夠特異性增強恥垢分枝桿菌對利福平的抗藥性。綜合這些結果，Ms4022是一個廣泛調控因子，發(fā)揮一個轉錄激活子的作用，它通過正調控與運輸相關的靶基因的表達，增強恥垢分枝桿菌對利福平的

6、抗藥性。
　　(2) LerR是恥垢分枝桿菌基因組編碼的另一個轉錄因子，含有LuxR結構域，也屬于TetR家族;它與激酶LerS組成一對雙組分系統(tǒng)，共同調節(jié)恥垢分枝桿菌對抗結核藥物乙胺丁醇的抗性。通過構建lerR超表達菌株并測定它在不同抗結核藥物脅迫下的生長曲線，結果發(fā)現(xiàn):與野生型菌株相比，超表達菌株對乙胺丁醇的抗性能力有顯著提高。隨后，EMSA和ChIP實驗證實LerR能夠在體內和體外特異性地結合Ms6242和Ms6239（1，

7、3-丙二醇脫氫酶PDH）的啟動子序列。進一步的qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，lerR敲除菌株中PDH以及操縱子Ms6242、Ms6241、Ms6240的表達量都顯著下降;相反，lerR超表達菌株中這些靶基因的表達量則增加。比較轉錄組分析發(fā)現(xiàn)，與沒有藥物脅迫相比，乙胺丁醇處理下的恥垢分枝桿菌中l(wèi)erR及其靶基因PDH、 Ms6242、Ms6241、Ms6240的表達量增加了2-4.5倍，說明這些基因均能響應乙胺丁醇的刺激。最后