在癲癇神經(jīng)元中miR-132調(diào)控BDNF-TrkB信號通路表達的研究.pdf

1、目的：顳葉癲癇是最常見的癲癇類型，且絕大多數(shù)是藥物難治性癲癇，其發(fā)病機制尚不十分清楚。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)促進了神經(jīng)元的存活、生長發(fā)育及分化等過程。其生物學功能主要通過特異性受體酪氨酸激酶B（tyrosine kinase receptor B, TrkB）介導而實現(xiàn)。近來研究表明BDNF-TrkB信號通路在癲癇的發(fā)生與發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。微小RNA(m

2、icroRNA)是一種內(nèi)源性非編碼蛋白的小分子RNA?，F(xiàn)已被證實其在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要功能。研究發(fā)現(xiàn)miR-132在癲癇發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用，但具體機制有待研究。本課題旨在通過檢測轉(zhuǎn)染miR-132后的海馬神經(jīng)元癲癇模型中TrkB蛋白磷酸化水平的變化，來了解其對BDNF-TrkB信號通路的調(diào)控作用，并探討其在癲癇發(fā)病中的作用。
　　方法：制備miR-132慢病毒表達載體。采用24小時內(nèi)新生Sprague Dawley

3、（SD）大鼠，取海馬神經(jīng)元體外原代培養(yǎng)7天。采用完全隨機化方法將細胞分為①正常組、②癲癇組、③正常+BDNF組、④癲癇+BDNF組、⑤正常+miR-132組、⑥癲癇+miR-132組、⑦正常+BDNF+miR-132組、⑧癲癇+BDNF+miR-132組。利用膜片鉗技術(shù)檢測海馬神經(jīng)元放電情況，熒光定量PCR法檢測海馬神經(jīng)元中miR-132的表達情況，利用免疫印跡技術(shù)檢測海馬神經(jīng)元中TrkB和p-TrkB蛋白的表達情況，Quantity

4、one軟件對TrkB及p-TrkB的灰度值進行分析，p-TrkB與TrkB的比值表示BDNF-TrkB通路的激活狀態(tài)。方差分析進行統(tǒng)計學分析，檢驗水準a=0.05，數(shù)據(jù)使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包進行分析，p≤0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　癲癇模型的制備方法是：細胞培養(yǎng)至第7d時，用“無鎂”細胞外液處理3h，建立大鼠海馬神經(jīng)元癲癇模型。
　　轉(zhuǎn)染miR-132組的處理方法是：培養(yǎng)至第7d時加入miR-132慢病毒稀釋液，2

5、4h后換成完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時。
　　加入BDNF組的處理方法是：于提取蛋白前10min在培養(yǎng)液中加入BDNF。
　　結(jié)果：
　　1、膜片鉗技術(shù)檢測海馬神經(jīng)元癇樣放電：
　　與正常組相比，體外培養(yǎng)7d后的癲癇模型組大鼠海馬神經(jīng)元自發(fā)性放電頻率明顯增加（p=0.001）。
　　2、熒光定量PCR法檢測miR-132表達示：與正常組相比，癲癇組miR-132表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.001）

6、。
　　3、蛋白免疫印跡結(jié)果顯示：
　　⑴與癲癇組相比，正常組 p-TrkB/TrkB值較高，差異有統(tǒng)計學意義（p=0.008）；
　?、婆c正常組和相比，正常+BDNF組 p-TrkB/TrkB值升高，差異有統(tǒng)計學意義（p=0.015）；
　?、桥c癲癇組相比，癲癇+BDNF組 p-TrkB/TrkB值升高，差異有統(tǒng)計學意義(p=0.012)；
　?、扰c癲癇+miR-132組相比，癲癇組p-TrkB/TrkB

7、值較高（p=0.004），癲癇+BDNF+miR-132組p-TrkB/TrkB值較高（p=0.030）。
　　4、結(jié)果提示：加入外源性BDNF后，正常組和癲癇組的p-TrkB/TrkB值均明顯升高。說明外源性 BDNF可以激活 BDNF/TrkB通路，而加入miR-132后，癲癇組和癲癇+BDNF組的p-TrkB/TrkB值均有所降低
　　結(jié)論：
　　1.癲癇狀態(tài)下，海馬神經(jīng)元miR-132表達增高。
　　2.