休眠期間苣荬菜芽根蛋白質(zhì)組的雙向電泳分析及質(zhì)譜鑒定.pdf

1、苣荬菜(Sonchus brachyotus DC.)為菊科苦苣菜屬多年生草本植物,是東北地區(qū)危害大豆的“三菜”之一,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大的損失?，F(xiàn)有除草劑只對(duì)苣荬菜的地上部分有防除效果,對(duì)地下部分卻無(wú)能為力。根本原因是除草劑在苣荬菜的地下芽根中傳導(dǎo)能力差,而且苣荬菜的地下部分能以休眠的方式渡過(guò)寒冷的冬季,翌年繼續(xù)危害。本研究利用雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)了休眠過(guò)程中苣荬菜芽根蛋白質(zhì)組的動(dòng)態(tài)變化,尋找并鑒定差異蛋白點(diǎn),旨在找到與休眠相關(guān)的蛋白

2、質(zhì),以探索其休眠機(jī)制,為防除苣荬菜提供新的思路。目前,國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)上述研究報(bào)道。
　　 本研究以多年生雜草苣荬菜的地下芽根為試驗(yàn)材料,對(duì)其進(jìn)行了兩方面的研究。首先對(duì)苣荬菜芽根總蛋白質(zhì)的提取方法進(jìn)行篩選并建立適合苣荬菜的雙向電泳分析體系,其次對(duì)休眠過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的苣荬菜取樣并進(jìn)行雙向電泳分析,找到差異蛋白點(diǎn),并對(duì)這些蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)確定Trizol沉淀法作為苣荬菜芽根總蛋白質(zhì)的提取方法

3、。
　　 以蛋白純度及SDS-PAGE電泳的分離效果為指標(biāo),比較了TCA-丙酮沉淀法、酚法、Tris-Hcl法、Tris-丙酮-酚法、Trizol沉淀法、苯酚-TCA-丙酮沉淀法、雙乙法七種方法提取的苣荬菜芽根的總蛋白,結(jié)果表明,Trizol沉淀法提取的苣荬菜芽根的蛋白純度最高,且SDS-PAGE電泳條帶最多、最清晰,雙向電泳圖譜清晰,蛋白點(diǎn)最多,基本沒(méi)有拖尾和橫縱條紋,是苣荬菜芽根總蛋白質(zhì)的最佳提取方法。
　　 (2)

4、建立并優(yōu)化了適合苣荬菜的SDS-PAGE電泳和雙向電泳分析體系。
　　 SDS-PAGE電泳:采用5％的濃縮膠和12％的分離膠,上樣量為15μg,樣品在濃縮膠時(shí),電流為10mA;到達(dá)分離膠后,電流為40mA,當(dāng)溴酚藍(lán)至膠底時(shí)電泳結(jié)束。
　　 雙向電泳:第一向等電聚焦使用24cm線性IPG膠條(PH=4-7),取約含1200μg總蛋白質(zhì)的450μL水化液,采用被動(dòng)水化上樣,水化14h。等電聚焦在20℃下進(jìn)行,50V,30m

5、in;100V,1h:300V,1h;500V,1h;1000V,1h;2000V,1h:5000V,1h:8500V,80000Vhr,500V,1h。電泳結(jié)束后將膠條依次用含有DTT和含有碘乙酰胺的平衡液各平衡15min。第二向電泳采用12.5％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠,預(yù)電泳45min,2w/膠;正式電泳5-6h,15w/膠。凝膠采用熱考染法進(jìn)行染色。
　　 (3)通過(guò)質(zhì)譜分析46個(gè)差異蛋白點(diǎn),得到45個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋