不同誘導條件對人骨髓間充質干細胞成軟骨分化影響的研究.pdf

1、軟骨組織工程引入國內的時間相對滯后，然而，上世紀90年代以來，軟骨組織取得了長足的發(fā)展，標志性的事件是曹誼林團隊在裸鼠背上構建成功具有人外耳形態(tài)的軟骨。然而，近二十年以來組織工程的研究成果始終局限在實驗室條件下，臨床轉化和應用步伐緩慢，已經周知，體外構建是軟骨組織工程應用于臨床的關鍵所在，在此進程中存在諸多瓶頸亟待解決，其中有三個關鍵的問題：（1）種子細胞選擇：可以應用與臨床轉化的軟骨種子如何選擇（2）種子細胞選擇后如何進行大規(guī)模擴增：

2、如何通過體外擴增獲得足夠數量和良好生物活性的種子細胞（3）種子細胞體外軟骨誘導的技術穩(wěn)定性問題。
　　針對以上敘述的三個核心問題，本次研究選擇骨髓間充質干細胞（BMSCs）作為種子細胞，試圖解決BMSCs如何在體外進行大規(guī)模擴增的問題。目前已知，可用于擴增的種子細胞、支架材料和生長信息是組織工程實驗得以實施的三個必要條件。其中，種子細胞的遴選篩選是最為核心的問題。適宜的種子細胞應當具有的基本特質如下：a，來源廣泛，同時對供區(qū)及機體

3、影響輕微；b,有較強的被擴增能力，適當條件下可以誘導為不同的目的細胞；c，與支架材料能夠緊密貼服；d，對周圍環(huán)境變化耐受力強，適應不同的應力條件。到目前為止，可以作為種子細胞的細胞包括：軟骨細胞（來源：自體和異體）、干細胞（來源：脂肪、臍帶或骨髓）。在上述細胞中，用于軟骨組織工程研究時，骨髓可經過常規(guī)的外科操作獲得，對供區(qū)組織的創(chuàng)傷小，骨髓中的間充質干細胞具有較強的增殖能力，擴增后可以得到滿足需求量的細胞用于構建軟骨，目前，骨髓間充質干

4、細胞作為種子細胞在體外的軟骨構建，以及體內的組織缺損修復，已經在大動物體內進行了大量前瞻性實驗研究，所以，骨髓間充質干細胞具備成為軟骨組織工程臨床應用實現突破的條件，因此，本次實驗選擇BMSCs作為研究對象。堿性成纖維細胞因子（bFGF）是人體內存在的要因子之一，主要功能是促細胞有絲分裂，除此之外，bFGF還能夠對細胞形態(tài)發(fā)生和分化產生誘導作用，bFGF的生物學作用主要包括，促血管重建、促創(chuàng)傷愈合，以及參與組織創(chuàng)傷和缺損的修復等，近些年

5、來在軟骨組織工程中的應用被不斷報道，本次實驗研究了對BMSCs在體外擴增過程中是否應用bFGF，通過對其細胞形態(tài)、增殖能力、成軟骨能力的比較得到相關結論：應用bFGF，可在實驗室條件下獲得足夠數量的BMScs，其增殖能力強，并具有良好的成軟骨活性。我們還注意到，細胞體外增殖具有逐漸衰減的特性，隨著擴增傳代數量的增加，細胞自身的擴增和定向分化能力逐漸減弱。當分別以高、低密度傳代時，傳代至同一代次，低密度傳代可獲得更多的數量，本論文在第二部

6、分通過比較高低密度傳代時其增殖、成軟骨能力的比較，為臨床應用提供更多借鑒。通過bFGF的應用以及傳代密度的控制可解決種子細胞的選擇以及大規(guī)模體外擴增問題。
　　在BMSCs體外大規(guī)模擴增的基礎上，本論文第三、四部分探討B(tài)MSCs體外軟骨誘導的技術穩(wěn)定性問題。在體外利用BMSCs構建特定形態(tài)的組織工程化軟骨，需要具備運行穩(wěn)定、程序成熟的誘導體系。BMSCs接種支架材料后，需要在一定誘導條件下，向成軟骨細胞方向分化，該過程的影響因素眾

7、多，主要包括：誘導劑、細胞接種密度、細胞空間分布結構、應力環(huán)境等。本輪文著重對支架材料中不同細胞接種濃度、不同起始誘導時間兩個重要因素進行探討。通過比較BMSCs以30×106/ml、60×106/ml、90×106/ml的密度接種于PLA/PGA支架材料塊，BMSCs接種于PLA/PGA支架材料塊后分別于低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)1d、3d、5d后，加入成軟骨誘導液，進行誘導后可知，60×106/ml的細胞濃度接種支架材料，接種后3d成軟骨誘導液

8、進行誘導更利于組織工程軟骨的體外構建，為BMScs體外軟骨誘導體系的建立提供重要依據。
　　本實驗技術路線簡介如下：（1）人髂骨處抽取骨髓3-5ml，洗滌、離心并吸取上次的脂肪后接種于培養(yǎng)皿中利用全骨髓培養(yǎng)法進行原代培養(yǎng)。實驗組：每500ml基礎培養(yǎng)液中，添加5ng bFGF；對照組：基礎培養(yǎng)液不添加bFGF，分別進行傳代培養(yǎng)，對第1、2、3、5代BMSCs做CCk8，生成細胞增殖曲線，并分別用第三代BMSCs做體外無支架材料軟骨

9、構建，用Ⅱ型膠原免疫組織化學的方法，檢測組織工程化軟骨特異性；（2）抽取骨髓做原代培養(yǎng)后，均用每500ml添加5ng bFGF的培養(yǎng)液進行傳代培養(yǎng)，分別以1:3、1:9比例進行傳代，并用第1-7代細胞分別進行體外無支架材料軟骨構建，用Ⅱ型膠原免疫組織化學的方法，檢測軟骨特異性；（3）抽取骨髓做原代培養(yǎng)后，用每500ml添加5ng bFGF的培養(yǎng)液、以1:3比例進行傳代培養(yǎng)，用第3代細胞，分別以30×106/ml、60×106/ml、90

10、×106/ml的細胞密度接種于PLA/PGA支架材料塊，以成軟骨誘導液誘導8周后實施檢測，主要檢測項目包括濕重，番紅O（Safranin-o）染色，HE染色，Ⅱ型膠原免疫組織化學檢測，Ⅱ型膠原定量；（4）抽取骨髓做原代培養(yǎng)后，用每500ml添加5ng bFGF的培養(yǎng)液、以1:3比例進行傳代、培養(yǎng)，用第3代細胞，以60×106/ml的濃度接種支架材料，分別用擴增培養(yǎng)基培養(yǎng)1d、3d、5d后，加入成軟骨誘導液進行誘導，誘導8周后分別作相關檢

11、測，具體項目同前。
　　本實驗結果簡介如下：（1）bFGF對體外組織工程化軟骨構建的影響：通過細胞增殖曲線可知，bFGF組1、2、3、5代細胞增殖能力高于非bFGF組；通過無支架組織工程軟骨構建結果可知，實驗組顏色潔白、體積大于非bFGF組，軟骨特異性Ⅱ型膠原免疫組織化學檢測，顯示軟骨陷窩形成均勻，明顯優(yōu)于對照組。（2）不同細胞密度傳代對構建的影響：細胞形態(tài)結果可知，BMSCs體外擴增過程中，分別以1:3和1:9的比例進行傳代，1

12、:3傳代組，BMSCs形態(tài)傳至第6代時仍能保持其梭形、紡錘形，傳至第8代時細胞分布、大小基本均勻，形態(tài)稍有鋪展并不無明顯變化，1:9傳代組，BMSC在第1、2、3代時形態(tài)梭形、紡錘形，形態(tài)鋪展不明顯，但在第4、5代時細胞數量極少且形態(tài)鋪展明顯；體外無支架組織工程軟骨構建結果可知，1:3傳代組，分別用P1、P3、P5代的BMSCs進行軟骨組織構建所形成的組織塊，體積依次減小對比明顯，但Ⅱ型膠原免疫組織化學檢測差異不明顯，用P5、P6、P7

13、代的BMSCs進行組織構建時，所形成的組織塊體積差異不大，但Ⅱ型膠原免疫組織化學檢測顯示，隨著接種代次的增加，其軟骨陷窩逐漸減少，其染色深度變淺，提示傳代至5后，隨著BMSCs接種代次增加，其Ⅱ型膠原的分泌量減小，在1:9傳代組，用P1、P2、P3代的BMSCs進行軟骨組織構建所形成的組織塊Ⅱ型膠原免疫組織化學檢測顯示，均有均勻的軟骨陷窩形成，但第3代以后的BMSCs不能形成軟骨，提示低密度傳代時，3代以內的BMSCs仍可用于組織工程軟

14、骨體外構建；（3）支架材料中不同細胞接種濃度對體外組織工程化軟骨構建的影響：支架材料中以30×106/ml、60×106/ml、90×106/ml三種不同細胞密度接種時，體積和厚度依次是60×106/ml組、90×106/m組、30×106/ml，其番紅O（Safranin-O）染色、HE染色以及Ⅱ型膠原免疫組織化學檢測提示，60×106/ml組軟骨陷窩分布均勻，染色厚重度明顯高于90×106/m組和30×106/ml組，但90×106

15、/m組和30×106/ml組并無明顯差異；（4）不同起始誘導時間對體外組織工程化軟骨構建的影響：在BMSCs接種到支架材料分別培養(yǎng)1d、3d、5d后開始加軟骨誘導液進行成軟骨誘導，所形成組織塊的大體觀中，以3d組最厚，1d和5d組所形成組織塊透明度明顯，其番紅O（Safranin-O）染色、HE染色以及Ⅱ型膠原免疫組織化學檢測結果顯示，3d組軟骨陷窩數量多、分布最均勻，染色厚重度亦明顯高于1d和5d組。
　　綜上所述，本實驗緊緊圍

16、繞制約組織工程化軟骨實施臨床應用面臨的三個主要問題，選擇BMSCs作為種子細胞作為研究對象，分別通過對體外擴增過程中是否應用bFGF、體外擴增過程中高低密度傳代對BMSCs體外增殖和成軟骨能力進行比較，結果顯示，通過應用bFGF以及傳代密度控制可獲取足夠數量和生物活性的種子細胞，從而解決種子細胞體外大規(guī)模擴增的問題。本論文第三、四部分分別通過對支架材料中30×106/ml、60×106/ml、90×106/ml三種不同細胞接種、接種后1