關于抗生素殘留飛行時間質譜分析方法學與青霉素降解規(guī)律的研究.pdf

1、飛行時間質譜具有采集速度快、靈敏度高、質量準確度高、分辨率高和m/z范圍寬等優(yōu)點，現已用于藥物的快速篩查以及藥物的降解代謝方面的研究?？股卦谛竽翗I(yè)中起著舉足輕重的作用，抗生素的濫用導致的各種藥物殘留給人類健康帶來了很大的危害。近年來，對抗生素的篩查檢測逐漸成為熱點，幾年前的“三聚氰胺”事件已引起人們對食品安全的高度重視。青霉素等抗生素在奶牛養(yǎng)殖業(yè)的濫用，其殘留對食品安全具有潛在的危險性。因此，飼料和食品中抗生素殘留檢測和“無抗奶”的鑒

2、定對于人類健康極為重要。“解抗劑”β-內酰胺酶的違規(guī)使用給乳制品中青霉素殘留檢測鑒定帶來困擾。本課題主要為飼料和食品中抗生素快速篩查與準確定量建立了液相色譜-飛行時間質譜高通量、多種類、多殘留、高靈敏分析新方法;考察了水溶液中青霉素降解和酶解規(guī)律及克拉維酸和舒巴坦的抑酶作用;首次探明了牛奶中青霉素降解和酶解規(guī)律,提出了牛奶中青霉素代謝途徑;利用制備色譜、質譜、紅外光譜和核磁共振譜分別制備和表征了可作為標準物和標示物的青霉素降解產物－脫羧

3、青霉素噻唑酸。本論文成果為食品安全檢測和評價提供了方法學基礎，具有重要的理論意義和實用價值。本文的主要內容如下：
　　1、介紹了飛行時間質譜技術的原理，并對飛行時間質譜技術在食品安全、抗生素降解、環(huán)境監(jiān)測、生物大分子分析等領域的應用進行了綜述。
　　2、優(yōu)化了全自動快速溶劑萃取雞飼料、豬飼料和魚飼料中23種抗生素獸藥的條件。在優(yōu)化的超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜(UPLC-QTOF-MS)條件下，自建了包括這些抗生素獸

4、藥母離子的保留時間、精確質量、元素組成和同位素等信息的數據庫。對各種飼料進行 QTOF-MSE掃描及數據采集,依據自建的數據庫，采用 MassLynx ChromLynx軟件進行快速篩查辨別，并采用標準品比對或二級質譜圖比對發(fā)現的陽性目標化合物進一步加以確認。所建立的快速溶劑萃取-UPLC-QTOF-MS方法用于飼料中23種限用或禁用的抗生素獸藥檢測具有良好的線性范圍、檢出限、精密度和準確度。檢測結果發(fā)現，所購商品獸藥均為三種以上限用抗

5、生素的混合物，商品獸藥中有效抗生素成分與標注的有效抗生素成分差異較大。有些飼料中還發(fā)現含有禁用的呋喃唑酮、利巴韋林和地美硝唑。該方法可用于飼料中抗生素殘留的快速篩查、確認和定量。
　　3、采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜（UPLC-QTOF/MS）技術,建立了一種簡單快速的同時測定蜂蜜中獸藥多種類、多殘留分析方法。研究對象包括林可霉素類、大環(huán)內酯類、磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、β-內酰胺類、硝基咪唑類、氨基糖苷類和激素類等

6、14類90種獸藥。樣品用改進的QuEChERS法處理效果良好，無需進一步凈化。通過ACQUITY UPLC? BEH C18色譜柱進行分離，以0.1％(V/V)甲酸水和乙腈作為流動相進行梯度洗脫。利用Analyst? TF1.6軟件建立了90種獸藥高分辨二級質譜數據庫和相應的4張不同碰撞能量的二級質譜圖，對藥物殘留進行篩查和確證?？疾煸u價了方法的線性、靈敏度、準確度、重現性和再現性。90種獸藥在至少2個數量級濃度范圍內基質匹配標準曲線線

7、性良好（R2>0.9933）。檢出限為0.10～5.41μ g/kg,定量限為0.32～18.03μ g/kg。日內精密度(RSD, n=6)不超過10.9%，日間精密度(RSD, n=6)不超過13.5%。3個添加水平平均回收率為70.63%～114.62%，相對標準偏差（n=6）為1.87%～9.57%。該方法操作簡單、快速、高效,高通量，適用于蜂蜜中多種類、多殘留獸藥的篩查和定量檢測。
　　4、利用高效液相色譜-飛行時間質譜

8、（HPLC-TOF/MS）研究了在水溶液中青霉素G、青霉素V、氨芐西林和阿莫西林的降解反應。探討了溫度與時間、酸度對降解反應的影響。結果表明：這四種青霉素在水溶液中的降解情況相類似，在pH在4到7之間，相對比較穩(wěn)定，而當溶液的pH超過8的時候，青霉素的降解速度加快，此時，青霉素僅降解為相應的青霉噻唑酸。完全降解10μg青霉素G、青霉素V、氨芐西林和阿莫西林所需β-內酰胺酶的量分別為10U、10U、11U和7U。在20℃~30℃條件下，青

9、霉素G、青霉素V、阿莫西林和氨芐西林完全降解所需的時間分別為2、2.5、2.5和1.5 h。當溫度低于40℃時，產物主要以青霉噻唑酸的形式存在，超過60℃時，酶解產物主要以脫羧青霉噻唑酸的形式存在。水溶液中青霉素和β-內酰胺酶的降解反應最適宜的pH為6～8，但是在不同的pH下，青霉噻唑酸和脫羧青霉噻唑酸的比例也不相同。研究結果對青霉素的臨床用藥和β-內酰胺酶的合理使用具有一定的指導意義，也為在β-內酰胺酶存在下乳制品中青霉素的降解研究提

10、供了思路和方法基礎。同時，研究了在水溶液中克拉維酸和舒巴坦對β-內酰胺酶的抑制作用。結果表明，克拉維酸的抑酶作用均強于舒巴坦，且阿莫西林和克拉維酸聯合時，對β-內酰胺酶的抑制作用非常明顯高于青霉素G、青霉素V和氨芐西林。通過考察克拉維酸和舒巴坦分別與β-內酰胺酶作用25min后的抑酶率，發(fā)現在水溶液中當克拉維酸和抗生素的比例達到1:1時，抑酶率達到100%;當舒巴坦和抗生素的比例達到8:1時，抑酶率達到100%。
　　5、利用高效

11、液相色譜-飛行時間質譜（HPLC-TOF/MS）研究了在牛奶中青霉素G、青霉素V、氨芐西林和阿莫西林的降解反應,提出了在β-內酰胺酶存在下牛奶中青霉素的降解途徑。通過比較試驗考察了β-內酰胺酶的用量、溫度、時間和酸度等因素對降解的影響。在β-內酰胺酶存在下牛奶中青霉素的降解規(guī)律與水溶液(pH6?7)中的降解規(guī)律相類似。在不同的溫度和pH條件下，青霉素的的兩種降解產物（青霉素G噻唑酸/脫羧青霉素G噻唑酸，青霉素V噻唑酸/脫羧青霉素V噻唑酸

12、，氨芐西林噻唑酸/脫羧氨芐西林噻唑酸,阿莫西林噻唑酸/脫羧阿莫西林噻唑酸)的比例是不同的。當 pH=6和低于40℃時，青霉噻唑酸是主要的降解產物，但其不穩(wěn)定，不能用作標準物來準確定量青霉素噻唑酸，也不能作為標示物來判定青霉素在牛奶中是否存在。在pH=2和高于40℃條件下，青霉素噻唑酸逐漸向脫羧青霉噻唑酸轉化，脫羧青霉噻唑酸是穩(wěn)定的降解產物，能夠用作標準物用于定量分析，也可作為標示物來推判青霉素在牛奶中是否存在。
　　6.通過對β-

13、內酰胺酶存在下青霉素降解規(guī)律的分析，建立了反相高效液相純化色譜制備脫羧青霉G噻唑酸、脫羧青霉V噻唑酸、脫羧氨芐西林噻唑酸和脫羧阿莫西林噻唑酸的方法，同時以紅外、核磁、色譜、質譜技術對對所制得產物脫羧青霉噻唑酸的進行了表征和確證。脫羧青霉G噻唑酸、脫羧青霉V噻唑酸、脫羧氨芐西林噻唑酸和脫羧阿莫西林噻唑酸的純度分別達到94%、92%、89%和91%。結果表明，此法制備脫羧青霉噻唑酸方便、可行，得到的產物可用用作標準物用于定量分析，也可作為標