Sirt1-Fox01在高糖誘導小鼠系膜細胞凋亡中的作用.pdf

1、目的:
　　糖尿病腎病(diabetic nephropathy DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥。以糖尿病腎病為原發(fā)病的終末期腎衰發(fā)病率逐年上升。在我國，每年花費大量的人力、物力、財力維持這些病人的治療。然而糖尿病腎病的發(fā)病機制仍不清楚，臨床上治療糖尿病腎病有待于新的突破。目前，雖然對于DN的發(fā)病機制仍不清楚，但是大量研究證實氧化應激在DN的發(fā)病機制中發(fā)揮了非常重要的作用。糖尿病的機體處于氧化應激狀態(tài)，促進了臟器實質細胞的損害

2、和凋亡的發(fā)生。ROS的產生與高糖誘導腎小球系膜細胞(mesangial cel1，MC)凋亡密切相關。而FoxO1(Forkhead Box，FOX)是PI3K/AKT信號通路中關鍵的轉錄調節(jié)因子。在氧化應激環(huán)境中，PI3K/AKT信號通路會促使FoxO1發(fā)生去磷酸化作用并增加其結合下游因子DNA的能力，從而定位于細胞核，增強其轉錄活性。FoxO1與氧化應激及氧化應激引起的細胞凋亡等密切相關。以前的研究已證實抑制FoxO1能夠保護脂肪酸

3、和內質網應激引起的胰腺β細胞的凋亡。同時也有實驗表明，Sirt1對FoxO1具有明顯的調控作用。然而，到目前為止，有關FoxO1與系膜細胞凋亡的具體關系以及Sirt1對FoxO1的作用還未見報道。在本項目中我們擬通過體外培養(yǎng)細胞，采用Sirt1激活劑SRT1720和FoxO1小干擾RNA敲低FoxO1表達，觀察Sirt1/FoxO1與腎臟系膜細胞凋亡的關系。為了研究在慢性腎臟疾病中腎臟實質細胞凋亡的分子機制。我們進一步檢測了凋亡相關蛋白

4、和部分凋亡相關信號通路。為慢性腎臟疾病的治療提供新思路。
　　方法:
　　采用FoxO1 shRNA干擾質粒和Sirt1激活劑SRT1720進行干預。使用Lipofectamine2000轉染試劑將FoxO1 shRNA質粒和對照質粒分別轉染MMCs，G418篩選穩(wěn)定的MMCs細胞系。以正常糖濃度(NG)培養(yǎng)的MMCs為對照，以HG刺激MMCs。TUNEL法檢測凋亡細胞數目，Western blot法檢測細胞內Sirt1、F

5、oxO1、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、caspase-3、SOD1、SOD2、p47，NOX4、β-actin蛋白的表達。RT-PCR檢測細胞Bax和Bcl-2的mRNA的表達。
　　結果:
　　1、FoxO1和Sirt1在系膜細胞表達
　　Western blot實驗結果顯示:與NG組相比，HG組FoxO1的表達明顯增加。FoxO1 shRNA質粒轉染能明顯抑制高糖誘導的FoxO1過表達。

6、證實FoxO1 shRNA對MMC的FOXO1上調抑制效果明顯。與NG組相比，HG組Sirt1表達明顯減少。Sirt1激活劑SRT1720能夠明顯提高高糖條件下Sirt1的表達，同時下調FoxO1的表達。FoxO1 shRNA質粒轉染對Sirt1的表達無明顯影響。
　　2、敲低FoxO1表達和SRT1720明顯抑制高糖誘導的MMC凋亡
　　TUNEL結果顯示，與NG組相比，HG組MMC凋亡明顯增多，與HG組和載體對照組相比，

7、FoxO1 shRNA轉染或SRT1720能夠顯著抑制HG誘導的MMC凋亡。表明FoxO1表達與高糖誘導的MMC凋亡密切相關。
　　3、敲低FoxO1表達和SRT1720下調高糖誘導的Bax/Bcl-2比值。
　　Western blot及RT-PCR實驗結果顯示，與NG組相比，HG組Bax/Bcl-2mRNA水平和蛋白表達比率顯著增加。與HG組和載體對照組相比，FoxO1shRNA轉染和SRT1720分別能夠明顯降低Bax

8、/Bcl-2 mRNA和蛋白的比率。表明FoxO1與高糖誘導的MMC凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2表達情況密切相關。
　　4、敲低FoxO1表達和SRT1720抑制高糖誘導的cleaved Caspase-3表達
　　Western blot實驗結果顯示，與NG組相比，HG組活化的Cleavedcaspase-3蛋白表達明顯提高。FoxO1 shRNA轉染或SRT1720干預后，高糖誘導的Cleaved caspase-3的

9、高表達明顯被抑制。證實，FoxO1的活化與高糖誘導的MMC凋亡相關蛋白Cleaved caspase-3表達情況密切相關。
　　5、敲低FoxO1表達和SRT1720對高糖誘導的SOD1、SOD2、p47及NOX4表達的影響
　　Western blot結果顯示，與NG組相比，HG組過氧化物酶SOD1，SOD2蛋白表達水平明顯降低;p47及NOX4蛋白表達則明顯增多。與HG組和載體對照組相比，轉染FoxO1 shRNA質?；?/p>

10、SRT1720干預能夠明顯上調高糖抑制的SOD1和SOD2表達，同時抑制p47及NOX4蛋白的表達。
　　結論:
　　1、高糖能夠上調系膜細胞FoxO1蛋白的表達;敲低FoxO1或Sirt1的激活劑SRT1720能夠減少HG誘導的細胞凋亡及Bax/Bcl-2、Cleaved caspase-3的表達。
　　2、高糖能夠下調sirt1的表達;Sirt1的激活劑SRT1720能夠抑制高糖誘導的FoxO1的表達。