SARS-CoV冠狀病毒M蛋白作為一類新的胞內病原相關分子模式上調Ⅰ型干擾素表達.pdf

1、天然免疫反應是機體抵抗外源性病原體入侵感染的第一道防線。天然免疫系統(tǒng)主要通過受染細胞中的模式識別受體(PRR)來識別病原體來源的病原相關分子模式(PAMP)。大部分的模式識別受體位于細胞膜或內體膜上以識別病原體相關的RNA、DNA或者人工合成的雙鏈RNA類似物如polyI:C，同時還有一些模式識別受體游離存在于細胞質中，識別病毒的DNA核酸。然而，目前對于侵入細胞內病原體所釋放出的蛋白質是否可以作為一類胞內的病原相關分子模式(PAMP)

2、來發(fā)揮激活先天免疫反應作用還不是很清楚。實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn)，在HEK293細胞中，轉染嚴重急性呼吸綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV)編碼的M基因可以誘導Ⅰ型干擾素（β干擾素）表達上調，然而具體機制并未得到深入的研究。在本論文研究中，我們發(fā)現(xiàn)轉染SARS-CoV冠狀病毒M基因可以上調HEK293T，HEK293ET以及永生化小鼠骨髓巨噬細胞J2-Mψ中IFNβ的基因表達，但在A549和Vero細胞中，M基因未能上調IFNβ啟動子的表達水

3、平，說明M基因上調IFNβ的現(xiàn)象可能具有組織細胞特異性。并且M基因同時激活了誘導Ⅰ型干擾素表達的TBK1-IRF3以及NFκB信號通路。通過構建M基因不翻譯的突變M-stop，并與正常M蛋白表達質粒進行功能比較，結果發(fā)現(xiàn)是M蛋白而不是M的mRNA誘導IFNβ的基因表達。此外，對干擾素表達通路中上游信號分子進行系統(tǒng)檢測，發(fā)現(xiàn)M蛋白激活IFNβ的基因表達與TLR受體通路中的銜接蛋白MyD88，TIRAP和TICAM2相關，而并沒誘導激活RI

4、G-Ⅰ和MDA5介導的信號通路。我們還通過免疫共沉淀的方法檢測了M蛋白與TLR受體通路MyD88和TRAM銜接蛋白的相互作用，結果為陰性，說明M蛋白可能通過間接的方式調控了TLR受體通路的銜接蛋白。由于蛋白表達實驗中發(fā)現(xiàn)M蛋白的條帶有拖尾現(xiàn)象，我們試圖檢測M蛋白是否可能發(fā)生了泛素化修飾，通過突變其預測可能發(fā)生泛素化的賴氨酸位點并構建突變進行表達檢測，同時對M蛋白與HA-Ub共轉后進行相互作用檢測，以及免疫沉淀M蛋白后進行質譜檢測，然而我

5、們得到的都是陰性結果，說明M蛋白在Western blotting實驗中檢測到的拖尾條帶不是泛素化修飾，可能發(fā)生了其他的翻譯后修飾。為進一步分析M蛋白發(fā)揮作用是否發(fā)生在細胞內，我們用蛋白分泌抑制劑brefeldinA(BFA)阻斷M蛋白由胞內向胞外的運輸，結果顯示加入BFA后并沒有抑制M蛋白誘導IFNβ的基因表達。用TLR2和TLR4受體的抑制劑阻斷可能的胞外信號轉導途徑，也沒有削弱M蛋白誘導IFNβ的基因表達，證明了M蛋白誘導IFNβ

6、活化的驅動力產生自細胞內部。構建TRAF3基因的siRNA進行瞬時轉染和穩(wěn)轉細胞系的構建，其并沒有影響M蛋白誘導IFNβ的轉錄表達過程，因而M蛋白誘導IFNβ的活化過程不依賴于TRAF3信號分子。SARS-CoV冠狀病毒的假病毒感染細胞后，誘導IFNβ的表達上調依賴于M蛋白，M蛋白點突變(V68A)產生的假病毒并不具有誘導IFNβ的表達上調的現(xiàn)象。同時，我們根據(jù)M蛋白親水區(qū)和疏水跨膜區(qū)構建了M蛋白的缺失突變體，發(fā)現(xiàn)M蛋白的疏水跨膜區(qū)對于