HSF1在LPS誘導大鼠發(fā)熱過程中參與調節(jié)PO-AH區(qū)TRPV1基因的表達.pdf

1、目的：
　　機體的體溫調節(jié)功能對于生命活動是非常重要的。當機體在感染等情況下會引起發(fā)熱反應，即出現(xiàn)調節(jié)性體溫升高。體溫升高將影響到機體的許多正常功能活動，但是在一般情況下人體這種調節(jié)性的體溫升高不會超過42℃，這說明體內存在著限制體溫過高的調節(jié)機制。然而，關于體溫調節(jié)中樞監(jiān)測及調控體溫的分子機制還不清楚。
　　瞬時感受器電位1(TRPV1)是近年來發(fā)現(xiàn)的具有溫度感受特性的TRP家族成員之一，是一種主要允許Ca2+通透的陽離子

2、通道。在體外，哺乳動物細胞的TRPV1可感受高于43℃的熱刺激，辣椒素及某些內源性介質能夠激活此通道。隨后，人們在腦內多個部位發(fā)現(xiàn)了TRPV1的存在，其中包括重要的體溫調節(jié)中樞視前區(qū)-下丘腦前部(PO/AH)。根據(jù)TRPV1感受的溫度范圍特點，提示PO/AH區(qū)的TRPV1可能參與機體發(fā)熱時體溫調控過程。但是，TRPV1作為體溫調節(jié)的元件，調控其表達的分子機制還不清楚。
　　熱休克反應(HSR)是生物體在熱應激或其他應激狀態(tài)下表現(xiàn)的

3、以基因表達變化為特征的防御適應反應，在生物體中普遍存在，參與廣泛的細胞機能的調節(jié)，具有重要的生物學作用。這一反應主要通過熱休克轉錄因子1（HSF1）在轉錄水平調節(jié)相關蛋白的表達。HSF1已被公認為是機體重要的轉錄調節(jié)因子，在機體對抗多種應激刺激中起重要作用。
　　關于HSF1是否參與TRPV1對體溫的調節(jié)作用目前尚無報道。我們推測存在于體溫調節(jié)中樞PO/AH的TRPV1的表達可能受HSF1的調控，為此，我們應用生物信息學技術分析了

4、TRPV1基因上游啟動子-2133bp的區(qū)域有無HSF1的結合位點，結果發(fā)現(xiàn)了有3處HSF1的潛在結合位點。
　　為進一步明確發(fā)熱時中樞體溫調節(jié)的分子生物學機制，本研究采用LPS致大鼠發(fā)熱模型及培養(yǎng)的大鼠神經膠質瘤細胞(PC12)，探討了HSF1是否在LPS誘導大鼠發(fā)熱過程中參與調控TRPV1基因的表達，并尋找在TRPV1基因上游啟動子中HSF1的結合位點。
　　材料與方法：
　　1、細胞培養(yǎng)
　　大鼠神經膠質瘤

5、細胞（PC-12）在含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基內，飽和濕度、37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，用于后續(xù)的轉染和雙熒光分析。
　　2、基因組DNA提取及目的DNA的PCR擴增反應
　　應用蛋白酶K降解和連續(xù)的酚-氯仿萃取法提取大鼠PO/AH區(qū)細胞內的基因組DNA。應用PCR擴增技術得到6個近端位點相同，遠端位點不同的TRPV1DNA片段，以翻譯起始點ATG定位為-1，遠端位點分別定位于-2123、-1425、-1160、

6、-821、-394和-254。PCR反應中在這6條DNA片段的上、下游分別連接BglⅡ和MulⅠ限制性酶切位點。
　　3、將上述目的DNA片段克隆至pGL3增強型熒光報告基因質粒
　　首先將上述目的DNA片段克隆至pMD18-T simple質粒中，應用BglⅡ和MulⅠ雙酶切及測序反應鑒定其長度是否準確，并進行堿基序列分析。應用BglⅡ和MulⅠ雙酶切pMD18-T simple質粒，回收目的DNA，應用T4DNA連接酶將

7、目的DNA序列克隆至pGL3增強型熒光報告基因質粒。
　　4、突變熒光報告基因質粒的制備
　　以pTRPV1/-1160熒光報告基因質粒作為模板，在HSE1元件中按照試劑盒說明書(Stratagene，La Jolla，CA)將堿基G突變成堿基T。
　　5、質粒的轉染與活性檢測
　　應用脂質體LipofectamineTM2000將螢光素酶報告基因質粒和對照質粒海腎熒光素酶(pRL-TK，內對照)轉染至PC12細

8、胞中。43℃熱處理15min，37℃培養(yǎng)4h后應用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測螢光素酶活性。
　　6、實驗動物及分組
　　(1)對照組，向SPF級SD大鼠(license：SCXK(Liaoning)2008-0005)腹腔注射1mL生理鹽水(n=12)。LPS組，向大鼠腹腔注射1mL LPS(80μg/kg，應用無菌生理鹽水稀釋，n=48)。
　　(2)PO/AH區(qū)樣品的采集：對照組在注射生理鹽水4h后采集，LPS組的樣品

9、采集分別在LPS注射后0h，2h，3h，4h和5h。
　　7、生物信號遙感術測量體溫
　　應用10％水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，通過腹正中切口向腹腔內植入發(fā)射子(model TA-F40，Respironics-Mini Mitter,Bend，OR)并將其固定在腹壁上，關閉腹腔，恢復7天。應用BW-200生理無線遙測系統(tǒng)(Chengdu Technology and Market Corp.，LTD)測量基礎體溫

10、和給藥后的實時體溫。
　　8、電泳遷移率分析(EMSA)檢測HSF1與TRPV1基因啟動子的結合
　　首先應用Thermo scientific公司的Biotin3'End DNA Labeling Kit標記含有HSE1反應元件的雙鏈DNA探針。然后與反應液混勻后室溫孵育20min。孵育結束后，每20μ1反應液中加入5μl5X Loading Buffer后混勻。樣品應用4％預電泳的非變性聚丙烯凝膠分離，并檢測樣品的遷移狀

11、況。
　　結果：
　　1、克隆6條5'系列截短的大鼠TRPV1基因啟動子序列
　　以大鼠PO/AH區(qū)基因組DNA為模板，克隆6條近端位點相同，遠端位點分別位于-2123、-1425、-1160、-821、-394和-254(以翻譯起始點ATG密碼子定位為-1)的TRPV1DNA片段，并且這些片段的上、下游分別含有BgiⅡ和MulⅠ限制性酶切位點。
　　2、構建含有6條5'端系列截短的大鼠TRPV1基因啟動子序列熒

12、光報告基因
　　將上述6條5'端逐漸截短的DNA片段連接到pMD18-T simple質粒中。應用T4DNA連接酶將目的DNA序列克隆至pGL3增強型熒光報告基因質粒。
　　3、構建大鼠突變型TRPV1基因啟動子報告基因
　　以pTRPV1/-1160熒光報告基因質粒作為模板，按照定點突變試劑盒說明書(Stratagene，La Jolla，CA)在HSE1元件中將堿基G突變成堿基T。
　　4、大鼠TRPV1報告

13、基因活性的檢測
　　(1)6個TRPV1基因啟動子的5'端突變體片段，分別轉染至PC-12細胞中，通過43℃、15min熱應激處理，發(fā)現(xiàn)轉染了包含pTRPV1/-2123、pTRPV1/-1425和pTRPV1/-1160片段質粒的細胞加熱后轉錄活性明顯升高，且三者之間沒有明顯的差異;而轉染了包含pTRPV1/-821、pTRPV1/-394和pTRPV1/-254片段質粒的細胞加溫后未檢測到明顯的轉錄活性。
　　(2)分別

14、將含有野生型HSE1(con.HSE)和含有突變型HSE1(mut.HSE)結構的pTRPV/-1160轉染至PC-12細胞。轉染24h后細胞給予上述的熱應激處理后檢測啟動子的活性。
　　結果顯示，HSE1序列中G到T的突變完全阻斷了加熱誘導的轉錄。
　　5、LPS致熱大鼠體溫變化
　　與對照組比較，大鼠注射LPS后體溫逐漸升高，在4h時出現(xiàn)發(fā)熱高峰，AT為1.38±0.19℃(n=12，P＜0.01)，之后體溫呈下降

15、趨勢。
　　6、LPS致熱大鼠PO/AH區(qū)TRPV1的表達
　　在LPS誘導發(fā)熱時，大鼠PO/AH區(qū)細胞TRPV1表達水平隨著體溫的升高明顯升高，并在LPS處理4h時達到高峰。此后，隨著體溫的降低而下降，這一變化與大鼠的體溫變化呈正相關（Y=1.298+4.410X，R=0.8047）。
　　7、LPS致熱大鼠PO/AH區(qū)細胞HSF1活性
　　(1)采用Western-blot方法，檢測了核內HSF1的表達量。<

16、br>　　結果顯示，核內HSF1的表達隨體溫的升高而逐漸增加，在LPS處理4h組HSF1的表達量升高最明顯。此后，體溫下降，HSF1的表達下調，這一變化與大鼠的體溫呈正相關(Y=0.5892+0.2703X,R=0.8435)
　　(2)采用細胞核染色和HSF1免疫熒光染色，分析了LPS誘導發(fā)熱過程中PO/AH細胞HSF1的亞細胞定位特征。
　　結果顯示，在對照組中HSF1主要定位于細胞質，而LPS處理4h后，大量HSF1轉

17、移至細胞核中。
　　8、在LPS誘導大鼠發(fā)熱時大鼠PO/AH區(qū)細胞中的TRPV1蛋白和HSF1蛋白的表達水平在體溫升高時都相應的增加，二者之間呈現(xiàn)正相關關系(Y=0.5608X+0.1586,R=0.8919)
　　結論：
　　1、LPS誘導大鼠發(fā)熱時，TRPV1的表達水平上調，并且與體溫升高水平呈正相關。
　　2、LPS誘導大鼠發(fā)熱時，HSF1的表達水平上調，與體溫升高水平呈正相關，并且由細胞質向細胞核遷移。<

18、br>　　3、在LPS誘導大鼠發(fā)熱時大鼠PO/AH區(qū)細胞中的TRPV1蛋白和HSF1蛋白的表達水平在體溫升高時呈現(xiàn)正相關關系(Y=0.5608X+0.1586，R=0.8919)
　　4、在PC12細胞中分別轉染野生型和突變型TRPV1啟動子報告基因，通過熱應激刺激，顯示TRPV1啟動子中的HSE1序列是誘導TRPV1基因轉錄的關鍵元件，并證實HSE1位于TRPV1基因轉錄起始點上游-919～-910區(qū)域。
　　5、在LPS