黃瓜霜霉病抗性相關基因篩選及過敏性抗病機制.pdf

1、黃瓜(Cucumis sativus L.)是國際上第3大蔬菜作物。由Pseudoperonosporacubensis(Berk.et Curt.)Rostow.專性寄生菌引起的霜霉病是瓜類蔬菜生產(chǎn)中一種最具毀滅性的世界性病害,給黃瓜生產(chǎn)造成了非常嚴重的損失,因此黃瓜霜霉病的防治一直為研究者和生產(chǎn)者所關注。實踐證明,培育抗病品種是最經(jīng)濟、環(huán)保、高效的途徑,而了解和掌握黃瓜霜霉病抗病機制,是尋找培育高效、穩(wěn)定抗病品種新方法的必由之路。從

2、基因表達整體水平上了解抗病相關基因表達的種類與數(shù)量,分析其相互關系,進而研究寄主抗病基因與病原菌的互作,是進行抗病機制研究的有效方法然而,到目前為止,有關黃瓜霜霉病抗性遺傳規(guī)律存在爭議,黃瓜霜霉病抗性基因調控機制知之甚少。因此,本研究首先評價了42個黃瓜品種(自交系)霜霉病抗性,篩選出高抗霜霉病的黃瓜自交系,選用抑制差減雜交方法(suppressionsubtractive hybridization,SSH)構建差減文庫,應用反向No

3、rthern高通量篩選技術篩選出差異表達片段,通過序列和生物信息學分析,確定參與抗病反應的基因數(shù)量和功能類別,從形態(tài)學、細胞學以及抗病相關基因的表達分析等方面,初步研究了黃瓜抗病自交系與病原菌的互作,為揭示復雜的抗病防御反應分子機理,確定更有效的抗病育種途徑,創(chuàng)建穩(wěn)定的抗性材料提供基礎。主要研究結果如下:
　　 1.選擇有代表性或大面積種植的42個品種(自交系)為材料,采用苗期噴霧接種和成株期田間自然感病的方法,進行3次獨立試驗

4、,對上述試材霜霉病抗性進行了評價。結果發(fā)現(xiàn),不同品種(自交系)對霜霉病的抗性存在較大差異。病情指數(shù)小于2.5為高抗霜霉病的材料,包括IL57、IL102、津春4號、農城4號、中農8號、園豐6號等,這些品種或自交系均屬華北類型,其中IL57平均病情指數(shù)最小,抗性最強。病情指數(shù)大于6為感霜霉病類型,包括IL101、IL112、津優(yōu)3號、津優(yōu)30號、新世紀和長春密刺等,其中IL112平均病情指數(shù)最大,抗病性最弱。相關性分析發(fā)現(xiàn),黃瓜成株期霜霉

5、病病情指數(shù)在不同試驗間呈極顯著相關,苗期與成株期的病情指數(shù)也呈極顯著相關,證明苗期抗病性與成株期抗病性一致。因此,選擇高抗自交系IL57和感病自交系IL112為后續(xù)研究材料。
　　 2.以高抗自交系IL57經(jīng)霜霉病菌接種32、48、56 h后和接種清水對照的葉片為材料,采用SSH技術構建了富集黃瓜霜霉病抗性相關基因的正、反向差減文庫。應用反向Northern斑點雜交技術進行篩選,從正、反向差減文庫中分別得到了60和26個非重復序

6、列片段(singleton ESTs)。其中,正向差減文庫的singleton ESTs涉及12種功能類別和未知功能。按所占比例大小依次為:未知功能、蛋白質合成、細胞運輸、初級代謝、轉錄調控、細胞防御、能量代謝、蛋白質降解、結合功能蛋白、信號傳導、次級代謝、細胞周期和DNA加工等。這些功能基因幾乎涉及了植物防御病原菌侵染的全部反應過程。反向文庫的非重復序列片段涉及9種功能和未知功能,即能量代謝、次級代謝、細胞防御、結合功能蛋白、初級代謝

7、、蛋白質合成、蛋白質降解、細胞運輸、信號傳導和未知功能等。在病原菌誘導下,下調基因的篩選將為研究黃瓜防御機制提供更全面的信息。
　　 在全部86個顯著表達的ESTs中,60個來源于正向差減文庫,占顯著表達ESTs總數(shù)的70％,下調特異表達的ESTs僅有30％。比較分析發(fā)現(xiàn),與正向差減文庫相比,反向差減文庫中有更多的次級代謝和能量代謝相關基因下調顯著,表明在霜霉病病原菌脅迫下,黃瓜參與次級代謝和能量代謝基因的表達更多地受到了抑制或

8、破壞。
　　 3.根據(jù)上述研究結果,選用黃瓜霜霉病的高抗自交系IL57和感病自交系IL112作為黃瓜與病原菌互作研究的試材,采用黃瓜苗期注射接種、噴霧接種以及田間自然感病等方法,觀察黃瓜霜霉病病情發(fā)展和病斑的形成。觀察發(fā)現(xiàn),無論采用何種接種方法,感病自交系IL112感染霜霉病后,病斑呈水浸狀、淺綠色。隨后病斑面積彌散型急劇擴大,水浸狀病斑逐漸失綠。感病后期,水浸狀病斑逐漸腐爛。高抗自交系IL57感染霜霉病初期,侵染部位呈水浸狀、

9、淺綠色病斑。隨著病情的進一步發(fā)展,病斑逐漸擴大、失綠,質地變成膜狀；菌絲不能穿過葉脈,病斑呈多角型,成熟病斑面積不再擴大,病斑中央穿孔,呈膜狀壞死,形成了典型的過敏性病斑。
　　 細胞組織化學研究發(fā)現(xiàn),霜霉病侵染黃瓜高抗自交系IL57后,抗病寄主在感病葉片侵染點周圍很快產(chǎn)生了大量的H2O2。伴隨過敏性反應的發(fā)生,侵染點和細胞壁周圍沉積了大量胼胝質和木質素。因此,黃瓜抗病自交系與霜霉病互作會發(fā)生非親和反應,迅速形成過敏性病斑,阻礙

10、病情的進一步發(fā)展。
　　 應用qRT-PCR技術,比較了34個ESTs在非親和反應和親和反應中的表達模式。結果表明,抗病相關基因在非親和反應和親和反應中存在差異,大部分抗病相關基因在非親和反應中早期特異表達或表達豐度特異增高。初步推測,在黃瓜與霜霉病的過敏性反應中,可能通過多胺代謝途徑生成了H2O2,G蛋白作為信號分子,也許部分調控了H2O2的生成和細胞程序性死亡。與此同時,超氧化物歧化酶(superoxide dismutas

11、e,SOD)、2-型金屬硫蛋白、肌醇半乳糖苷和半乳糖苷系列寡糖(raffmose family oligosaccharides,RFOs)或許作為活性氧清除機制的重要成分,保護細胞不受過量活性氧的危害。H2O2可能與木質素氧化交聯(lián),激活β-半乳糖苷酶和延伸因子1-alpha基因的表達,導致細胞壁的重排和加厚。泛素-蛋白酶體途徑可能參與過敏性反應。此外,轉錄因子、細胞防御、植保素合成等信號傳導和整合,可能最終介導了黃瓜抵御霜霉病的抗病反