腫瘤壞死因子相關(guān)調(diào)亡誘導(dǎo)配體TRAIL參與雷帕霉素誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞功能損傷的體外研究.pdf

1、目的：探討雷帕霉素(rapamycin)對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）凋亡和增殖、遷移、成血管能力的影響以及腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)表達水平的變化。
　　 方法：取體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)按1×105個/孔密度接種至6孔板中并分為四組：(1)正常對照組：加入配制雷帕霉素的溶劑（含0.1％DMSO的RPMI1640培養(yǎng)基）與內(nèi)皮細胞共同孵育24h;(2)雷帕霉素各濃度干預(yù)組（共3組）：分別用1、

2、10、100ng/mL雷帕霉素（含0.01％DMSO的RPMI1640培養(yǎng)基）與內(nèi)皮細胞共同孵育24h。
　　 將上述四組細胞分別采用CCK8法檢測細胞的增殖能力；transwell小室、劃痕試驗檢測細胞遷移能力；Matrigel體外成血管試驗檢測細胞成血管能力；DAPI染色在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)的改變；取四組細胞提取蛋白，用特異性的activatedcaspase-3抗體的蛋白免疫印跡法(Westernblo

3、t)檢測activatedcaspase-3的表達以顯示血管內(nèi)皮細胞的凋亡；用特異性的TRAIL抗體的蛋白免疫印跡法(Westernblot)檢測TRAIL在凋亡的內(nèi)皮細胞中的表達。
　　 結(jié)果：CCK-8法顯示在細胞增殖能力方面，與對照組相比，1ng/mL雷帕霉素對ECs的增殖能力無明顯影響，10～100ng/mL雷帕霉素顯著抑制ECs的增殖能力(P＜0.01)。
　　 細胞遷移能力方面，通過transwell小室、劃

4、痕試驗均顯示雷帕霉素(1～100ng/mL)能抑制ECs的遷移能力(P＜0.01)。
　　 體外成血管能力方面，10ng/mL、100ng/mL雷帕霉素組倒置顯微鏡下(×200)計數(shù)小管數(shù)與對照組相比明顯減少。
　　 通過DAPI染色在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，雷帕霉素處理組可出現(xiàn)部分染色質(zhì)濃縮、細胞核呈碎塊狀濃染等細胞凋亡形態(tài)學(xué)改變。
　　 采用Westorn-blotting法檢測c

5、aspase-3蛋白的活化來顯示細胞凋亡率，結(jié)果顯示：(1-100)ng/mL雷帕霉素能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡(P＜0.01)。
　　 通過Westernblot對不同濃度雷帕霉素作用于ECs24h后細胞TRAIL蛋白的表達情況進行檢測表明，除1ng/mL雷帕霉素作用組外，10ng/mL、100ng/mL雷帕霉素作用24h后TRAIL表達與對照組比較顯著增加(P＜0.01)，且10ng/mL、100ng/mL雷帕霉素作用組與1ng/