甜菜堿對血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　 探討甜菜堿對HUVEC的氧化損傷是否具有保護作用,探討HUVEC在氧化損傷條件下,甜菜堿對凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax表達的影響,對細胞中SOD活性和MDA含量及細胞培養(yǎng)上清中NO含量的變化,揭示甜菜堿發(fā)揮作用的機制,為評價甜菜堿的藥用價值提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 應用膠原酶消化灌注法提取原代HUVEC,采用形態(tài)學觀察和Ⅷ因子抗體免疫熒光檢測法相結合進行鑒定,以確保內(nèi)皮細胞的來源準確。細胞前

2、兩代進行實驗。取對數(shù)生長期的細胞按如下分組進行處理:(1)正常對照組;(2)H2O2損傷模型組:H2O2(H2O2的濃度為1mmol/L,);(3)甜菜堿低劑量組:甜菜堿(9.3mg/L)+H2O2;(4)甜菜堿中劑量組:甜菜堿(28mg/L)+H2O2;(5)甜菜堿高劑量組:甜菜堿(84mg/L)+H2O2;干預4小時后,應用形態(tài)學觀察法和MTT法檢測各組血管內(nèi)皮細胞增殖存活情況;應用流式細胞技術和AO、EB聯(lián)合染色法觀察各組細胞凋亡

3、的情況;應用免疫細胞熒光技術和免疫細胞化學法檢測各組細胞中Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達的情況;利用試劑盒檢測細胞中SOD的活性和MDA的含量以及細胞上清中NO的含量變化,以此分析甜菜堿保護HUVEC氧化損傷的可能機制。
　　 結果:
　　 1培養(yǎng)的細胞在倒置顯微鏡下觀察可見細胞貼壁單層生長細胞多為梭形或多角形,呈現(xiàn)特征性“鋪路石”樣排列。Ⅷ因子抗體免疫熒光技術檢測到95％以上的細胞發(fā)出黃綠色熒光,表明培養(yǎng)的細胞為血管內(nèi)

4、皮細胞。
　　 2形態(tài)學觀察H2O2損傷組的細胞損傷明顯,細胞大面積的脫落,經(jīng)甜菜堿低、中和高濃度干預的細胞損傷情況有明顯的改善,并且隨著甜菜堿濃度的增高,細胞受損傷的程度越輕。MTT法結果表明,甜菜堿能明顯的抑制HUVEC的減少,并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關系。
　　 3流式細胞技術檢測甜菜堿中濃度和高濃度可以明顯的抑制細胞的凋亡,AO、EB雙染色的結果基本與流式細胞技術檢測的結果一致。
　　 4免疫熒光檢測甜菜堿

5、可以使氧化損傷細胞中的抑凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯增加而促凋亡蛋白Bax的表達明顯減少,免疫細胞化學檢測結果與免疫熒光結果一致。
　　 5甜菜堿使氧化損傷的細胞中SOD的活性明顯升高而MDA的含量明顯降低,使細胞上清中NO的含量明顯增加。
　　 結論:
　　 1甜菜堿可以有效的抑制HUVEC的凋亡,保護HUVEC的活性。
　　 2甜菜堿抑制細胞的凋亡機制與提高Bcl-2蛋白的表達和降低Bax蛋白的表達相